液相色谱方法开发策略

吴园生吴园生吴园生吴园生WatersAsiaHeadquarter如何选择理想的如何选择理想的如何选择理想的如何选择理想的HPLCHPLCHPLCHPLC分析柱与制备柱分析柱与制备柱分析柱与制备柱分析柱与制备柱©2005WatersCorporation纲要纲要纲要纲要•何谓理想何谓理想何谓理想何谓理想HPLCHPLCHPLCHPLC色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱?•现代液相柱技术的最新进展现代液相柱技术的最新进展现代液相柱技术的最新进展现代液相柱技术的最新进展•系统系统系统系统、、、、快速液相色谱方法开发策略快速液相色谱方法开发策略快速液相色谱方法开发策略快速液相色谱方法开发策略•制备型色谱柱的选择诀窍制备型色谱柱的选择诀窍制备型色谱柱的选择诀窍制备型色谱柱的选择诀窍•总结总结总结总结©2005WatersCorporation您在日常您在日常您在日常您在日常HPLC分析工作中所面临的主要问题分析工作中所面临的主要问题分析工作中所面临的主要问题分析工作中所面临的主要问题PeakTailingRetentionReproducibilityProductQualityPriceWatersPeakTailingRetentionReproducibility峰拖尾:28%保留时间不重现:25%分离不佳:24%柱寿命太短11%极性化合物保留不佳:12%©2005WatersCorporationpH0.111010002468101214保留因子保留因子保留因子保留因子(k)酸酸酸酸(未离子化未离子化未离子化未离子化)中性化合物中性化合物中性化合物中性化合物碱碱碱碱1碱碱碱碱1+2(完全离子化完全离子化完全离子化完全离子化)酸酸酸酸(完全离子化完全离子化完全离子化完全离子化)碱碱碱碱2NA,B1B2(未离子化未离子化未离子化未离子化)B1NAB2pH5.5pH6.0您的分析方法为何重现性不佳您的分析方法为何重现性不佳您的分析方法为何重现性不佳您的分析方法为何重现性不佳?流动相缓冲流动相缓冲流动相缓冲流动相缓冲pH值是否靠近分析物的值是否靠近分析物的值是否靠近分析物的值是否靠近分析物的pKa范围范围范围范围?如图所示如图所示如图所示如图所示,满意在近中性满意在近中性满意在近中性满意在近中性pH区间分析可离子化化区间分析可离子化化区间分析可离子化化区间分析可离子化化合物时需要对流动相合物时需要对流动相合物时需要对流动相合物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制进行非常仔细的控制进行非常仔细的控制进行非常仔细的控制!!©2005WatersCorporation0.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.01230.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.4312pH5.20.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00132pH5.61320.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果Column:XTerra®RP184.6x100mm,5µmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8)or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10µLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA©2005WatersCorporation0.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH7.03120.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH6.83121.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl132pH5.81.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.000.000.100.200.300.40Column:XTerra®RP184.6x100mm,5µmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8)or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10µLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果©2005WatersCorporation分析方法对pH敏感度的测试-优异的结果©2005WatersCorporation杂化颗粒柱对创建稳定可靠的杂化颗粒柱对创建稳定可靠的杂化颗粒柱对创建稳定可靠的杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值分析方法的独特价值分析方法的独特价值分析方法的独特价值Note:ColumnParticle,Temperatureand%OrganicHeldConstant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobilePhase:35%MeCN,65%20mMBuffer稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区硅胶柱硅胶柱硅胶柱硅胶柱Xterra&X-Bridge杂化颗粒柱杂化颗粒柱杂化颗粒柱杂化颗粒柱©2005WatersCorporation您在日常您在日常您在日常您在日常HPLC分析工作中所面临的主要问题分析工作中所面临的主要问题分析工作中所面临的主要问题分析工作中所面临的主要问题PeakTailingRetentionReproducibilityProductQualityPriceWatersPeakTailingRetentionReproducibility峰拖尾:28%保留时间不重现:25%分离不佳分离不佳分离不佳分离不佳:24%柱寿命太短11%极性化合物保留不佳:12%©2005WatersCorporation()()1kk14NRs22+´α−α´÷=影响分离度的若干因素影响分离度的若干因素影响分离度的若干因素影响分离度的若干因素柱效柱效柱效柱效N↑↑↑↑2,2,2,2,R↑↑↑↑40%40%40%40%分离选择性分离选择性分离选择性分离选择性(方法开发归根结底是如何使得方法开发归根结底是如何使得方法开发归根结底是如何使得方法开发归根结底是如何使得α≠≠≠≠1)1)1)1)保留因子保留因子保留因子保留因子K最佳最佳最佳最佳=5©2005WatersCorporation如何在实践中调控如何在实践中调控如何在实践中调控如何在实践中调控‘αααα’?这是方法开发的根本这是方法开发的根本这是方法开发的根本这是方法开发的根本!分离柱分离柱分离柱分离柱流动相溶剂选择流动相溶剂选择流动相溶剂选择流动相溶剂选择流动相流动相流动相流动相pHαααα©2005WatersCorporation在林林总总的色谱柱中在林林总总的色谱柱中在林林总总的色谱柱中在林林总总的色谱柱中,方法开发应从何开始方法开发应从何开始方法开发应从何开始方法开发应从何开始?•SunFire™–最新的基于超纯硅胶的直链型C18和C8柱•SymmetryShield™–高纯硅胶柱提供高度重现结果,绝佳峰形,与C18/C8相比具正交性分离选择性,可用于全水相分离•X-Bridge™&XTerra®–方法开发者的首选柱–宽pH应用范围,多种键合相和多种粒径供选择•Atlantis™–dC18转为极性化合物而设计，已在工业界获广泛使用–Hilic提供真正与dC18相互补的分离选择性©2005WatersCorporation从您最熟悉的路径开始:首先尝试用高纯硅胶柱在低首先尝试用高纯硅胶柱在低首先尝试用高纯硅胶柱在低首先尝试用高纯硅胶柱在低pH下构建分析方法下构建分析方法下构建分析方法下构建分析方法为何首先用为何首先用为何首先用为何首先用SunfireC18在在在在pH3下分离下分离下分离下分离?
峰形有保障峰形有保障峰形有保障峰形有保障
柱寿命长柱寿命长柱寿命长柱寿命长
pH3为稳定保留区为稳定保留区为稳定保留区为稳定保留区，，，，方法稳方法稳方法稳方法稳定可靠定可靠定可靠定可靠样品样品样品样品不肯定不肯定不肯定不肯定?否否否否AtlantisdC18AtpH2-5SunfireC18AtpH3SymmetryShieldRP18AtpH3XterraRP18AtpH3AtlantisHILICAtpH2-5不成功不成功不成功不成功?是否属亲水是否属亲水是否属亲水是否属亲水性化合物性化合物性化合物性化合物?是是是是不成功不成功不成功不成功?无充分保留无充分保留无充分保留无充分保留!仍不成功仍不成功仍不成功仍不成功?转向高转向高转向高转向高pH分离分离分离分离!Preparationof10mMNH4COOHbufferatpH3:•For2litersof10mMbuffer,weightout1.26gofNH4COOH•Add2litersofwaterandstiruntildissolved•AdjusttopH3withformicacid©2005WatersCorporation如何实施低如何实施低如何实施低如何实施低pH下的三柱分析方案下的三柱分析方案下的三柱分析方案下的三柱分析方案?换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性0-80%gradientACN-H20,10mMbuffer,pH3成功分离成功分离成功分离成功分离?0-80%gradientMeOH-H20,10mMbuffer,pH3成功分离成功分离成功分离成功分离?方法再优化方法再优化方法再优化方法再优化是是是是否否否否SunfireC18AtpH3方法再优化方法再优化方法再优化方法再优化0-80%gradientACN-H20,10mMbuffer,pH3成功分离成功分离成功分离成功分离?0-80%gradientMeOH-H20,10mMbuffer,pH3成功分离成功分离成功分离成功分离?方法再优化方法再优化方法再优化方法再优化是是是是否否否否方法再优化方法再优化方法再优化方法再优化是是是是是是是是SymmetryShieldRP18AtpH3否否否否0-80%gradientACN-H20,10mMbuffer,pH3成功分离成功分离成功分离成功分离?0-80%gradientMeOH-H20,10mMbuffer,pH3成功分离成功分离成功分离成功分离?方法再优化方法再优化方法再优化方法再优化是是是是否否否否方法再优化方法再优化方法再优化方法再优化是是是是否否否否XterraRP18AtpH3©2005Wate