高效液相色谱-HPLC

（一）高效液相基础知识高志国（2017.03.29）2017年样品检测组操作技能培训色谱法原理与分类HPLC的组成HPLC的应用HPLC色谱图名词术语HPLC定量分析原理高效液相色谱基础知识什么是色谱法色谱法溯源Tswett（茨维特)的实验色谱法原理色谱法的分类色谱法原理及分类色谱法是一种现代的分离分析方法1906年正式命名(见诸文献)20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代什么是色谱法100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)色谱法(Chromatography)溯源一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带分离出不同的化合物Chromato--颜色Graphy--图象Tswett（茨维特)的实验是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase)有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂,溶剂色谱法原理相(Phase):物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面色谱分离原理按流动相的物态分:气相色谱(GasChromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(LiquidChromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)色谱法的分类按固定相的形态分:平面色谱o纸色谱o薄层色谱柱色谱色谱法的分类色谱法的分类示意图高效液相色谱法–HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)–是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:oHigh高oPerformance性能oLiquid液体的oPerformance色谱什么是HPLC？特点：高压、高效、高速、高灵敏度1.高效分离：n=105/米2.高速：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟3.高灵敏度：检测下限：10-9-10-13g（最小检测量）4.自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站5.应用范围广：可测有机物75%-80%适用：高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离HPLC特点按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(NormalPhaseChromatography)o固定相的极性大于流动相反相色谱(ReversedPhaseChromatography)o固定相的极性小于流动相有机化合物的极性分子间作用力(静电引力,偶分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种表述液相色谱法的分类有机化合物极性示例按分离过程的机理分:1吸附色谱(AbsorptionChromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离2分配色谱(PartitionChromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同3离子交换色谱(IonExchangeChromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)4体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)GPC(GelPermeationChromatography)•固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂GFC(GelFiltrationChromatography)•固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液液相色谱法的分类由五大部分组成：：溶剂输送系统（贮液器，高压泵）进样系统（进样阀等）分离系统（色谱柱等）检测系统（检测器等）记录及数据处理系统HPLC的组成1.高压输液泵为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）恒流泵（多用）：往复式注射式作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。性能：①有足够的压力②输出流量恒定，可调③输出压力平稳④泵室体积小⑤泵体抗腐蚀、耐酸梯度洗脱装置作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续改变配比，以改变流动相极性、离子强度、PH值、提高分离效率。低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，1个泵。）高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）安捷伦泵：小视频色谱学堂：泵高效液相色谱仪流动相脱气的目的1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。3、防止气泡引起尖峰。4、使基线稳定，提高信噪比。5、降低溶剂的紫外吸收本底。6、减少死体积。7、防止填料氧化。视频：脱气目的在线脱气机在线脱气机2.进样装置进样视频：安捷伦进样视频：岛津3.分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温匀浆法填充柱：将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米4.检测器要求:灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,对温度和流速的变化不敏感检测器类型1.紫外可见吸收检测器(UVD)2.荧光检测器(FD)3.蒸发光检测器（ELSD）3.示差折光检测器(RID)4.电化学检测器(ED)5.化学发光检测器(CD)1.紫外—可见光度检测器：①固定波长：254nm，低压汞灯。②可调波长：190～800mm，钨灯，氘灯。③光电二极管矩阵检测器：190～700nm。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液光电二极管矩阵检测器特点：灵敏度高、分辨率好、方便、快速、准确，可扫描得三维流出曲线紫外检测器的应用：对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。紫外检测器的特点：灵敏度高最小检测浓度10-9g/ml线性范围宽对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱应用范围广折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）因n～f（T），故需精密恒温（±0.001℃）灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱用于无紫外吸收的化合物，如糖类2.荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）荧光分光检测器（光栅分光）氘灯作激发光源，波长范围250～600nm应用：组分吸收一定波长紫外光后发射荧光的物质，且荧光强度与浓度成正比。特点：灵敏度更高检测限10-12～10-13g/ml（灵敏度比UV检测器高2~3个数量级）选择性好对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱所需试样量少，适于痕量分析应用范围广3、电化学检测器电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。伏安计、安培计、库仑计和电导计等,首选安培计可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质电极表面易中毒温度：10～30℃；相对湿度：80％；最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施HPLC的日常维护与保养HPLC的日常操作条件：1Alliance液相色谱系统日常维护：开机程序2Alliance液相色谱系统日常维护：开机程序HPLC的日常操作选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。手柄位在Load位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中(定量环充满后，多余样品从放空孔排出)手柄转动至Inject位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析工作原理：1.六通阀进样器的使用及保养手柄转动要快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留部分装液法：进样量最多为定量环体积的75％要求每次进样体积准确、相同完全装液法：进样量最少为定量环体积的3至5倍将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精密度及重现性两种装液方法:样品必须过滤：用0.45(0.22)m的滤膜过滤防止微粒阻塞进样阀减少对进样阀的磨损进样结束冲洗进样器：用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧使用流动相尽量要清洁进液处的砂芯过滤头要经常清洗流动相交换时要防止沉淀避免泵内堵塞或有气泡每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染2.泵的保养在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净要注意流动相的脱气避免使用高粘度的溶剂作为流动相进样样品要提纯；严格控制进样量2.色谱柱的保养每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器；在分析完成后马上关闭检测器3.紫外灯的保养“分析型液相色谱”目的:得到数据-定性及定量分析–灵敏度的要求–样品的复杂性–样品量的要求–精度及准确度的要求–容易使用HPLC的应用“制备型液相色谱”目的:得到纯品-分离及纯化–化合物的稳定性–样品的复杂性–制备量的要求–纯度的要求，及纯度的鉴定–方法的安全性色谱图(Chromatogram):
色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间HPLC色谱图名词术语色谱峰(Peak):):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号峰底(PeakBase):):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(PeakHeight):):峰最大值到峰底的距离峰面积(PeakArea):):峰与峰底之间的面积,又称响应值色谱图名词术语:基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号基线飘移(BaselineDrift):基线随时间定向的缓慢变化基线噪声(N)N)(BaselineNoise):由各种因素所引起的基线波动谱带扩展(BandBroadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象色谱图名词术语:保留时间(tR)(Retentiontime):组分从进样到出现峰最大值所需的时间死时间(t0)(Deadtime):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间保留体积(VR)(Retentionvolume):组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积死体积(V0)(Deadvolume):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积色谱图名词术语:等度在整个运行过程中溶剂组成保持不变如(60:40甲醇/水)HPLC实验的基本类型-等度梯度在运行过程中溶剂组成变化渐变或台阶式变化如100%H20/0%MeOH到0%H2O/100%MeOHHPLC实验的基本类型-梯度这些是导出理论和定义所必需的基本测量洗脱体积和峰宽简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远分离度(R)的定义式计算分离度的实例:分离程度的量度k′是样品与填料作用强度的直接量度保留因子(k′):保留能力的量度α是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异