DNA的复制

第三章DNA的复制第一节半保留复制的验证半保留模型（semioconservetivemodel）全保留复制模型(conservetivemodel)分散模型(Dispersivemodel)。半保留复全保留复分散模型制模型制模型15N15N15N15N15N15N第一次复制14N15N15N14N15N15N14N14N14N14N15N15N15N15N14N14N第二次复制图11-1三种不同的复制模型验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验二、Taylar实验三、姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，简称BUdR）斑色染色体（Harlequinchromosome）四、Cairns复制模型—θ型复制15N15N14N14N/15N15NDNA浓度14N14N/15N15N离心第14N一14N15N14N15N次离心实验14N15N14N14N14N14N14N15N离心第离心二次实验14N15N离心密度(a)(b)(c)图11-2Meselson-Stahl实验(a)实验结果的解释(b)SsCl梯度离心的结果；(c)离心后DNA的吸受率图11-4Taylor蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。(a)2H3H2H2H(b)2H3H2H2HT/T第一周期M1T/BUdRBUdR/T第二周期M2BUdR第三周期M3第四周期M4图11-5姊妹染色单体差别染色的原理和结果3H+CED1.5代BA放射自显影图11-7Cairns实验原理及过程第二节复制的起点、方向和终点一.研究方法：1.用同位素标记电镜观察及变性法2.用噬菌体插入标记法同步培养不同步培养3.变性定性法（denaturationmapping）4.双向电泳法Orit/Orit(a)(b)图11－8(a)若有固定起始点，双向负制，则复制终点应在起点的对面。(b)若有固定起始点,单向复制，则复制终点应和起点重叠。图例：未标记，轻标记，重标记图11-10用同位素标记复制叉来确定是单向复制还是双向复制图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同复制起点标记的拷贝数应最多1234123121RR0123第一组中性琼脂糖电泳+－第二组碱性琼脂糖电泳+(b)(a)(c)探针1杂交探针2杂交探针3杂交图12-13双向电泳定位法二、原核的复制起点和方向E.coli定点、双向对称复制。T7在近一端的17％处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组进行时双向复制。质粒ColE1有固定起始点，但却为单向复制。mtDNA进行D（displacedloop）环复制真核有多个复制起点（i），双向等速复制。OriOriOri(a)枯草杆菌(b)R6K质粒(c)ColE1图11-14原核生物中特殊的复制类型D环复制第三节DNA复制突变型的筛选一.根据温度敏感性筛选二.同位素标记法筛选三.5－溴尿嘧啶掺入法四.质粒温度敏感性的筛选五.根据抗药性筛选六.根据与突变有关的生物学功能筛选七.快停突变与慢停突变第四节原核生物复制的酶系统一.DNA合成酶DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5’→3’;（4）除聚合DNA外还有其它功能。表11-1E.coli中的三种DNA多聚酶DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ结构分子量109KD90KD900KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞400？10-20酶活性：5→3`聚合酶+++3`→5`外切酶+++5`→3`外切酶+－－(可切单链)突变体突变位点polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制(一).DNA聚合酶I的结构DNA聚合酶有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3’－OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)5’→3’外切酶结合位点；(6)3’→5’校正位点。聚合3'－5'外切5'－3'外切3'5'dNTPNMP5'3'图11-19DNA聚合酶Ⅰ的结构和功能(二).DNA聚合酶Ⅰ的功能1.5’→3’聚合功能2.3’→5’外切活性3.5’→3’外切活性(1)切口平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转换（template-switching）4.内切酶活性5'3'GTAAGTCG·····CTCAGC5'3'3'－5'外切核酸酶水解部位图11-20DNA聚合酶Ⅰ的3'－5'外切酶活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-16)3'5'GGACAAGA·····GACGTTCT5'3'内切酶水解部位图11-22DNA聚合酶Ⅰ的内切酶活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-20)5'3'-OH5'-P3'5'3'3'5'缺口平移链的置换模板转换5'3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'(a)(b)(c)图12-21DNA聚合酶Ⅰ5'－3'外切活性的功能(三)DNA多聚酶Ⅲ的结构PolⅢ*核心酶α：130K(polC即dnaE)—DNA合成(470K)(165K)ε：25K(dnaθ)—3'－5'外切酶活性,校对2核心＋2τ合成DNAθ：10K—使核心酶相互连接。PolⅢ'增加进行性(750K)τ：71K(dnaZX)—使核心酶形成二聚体，与模板连接。具有全酶使γδ复ATP活性。合成前合体结合导链和模板δ：32KEFⅢ,催化β亚基转移到模板链上。EFⅡ后滞链γδ复合体γ：52K(dnaZX)催化β亚基转移到模板链上。(附加亚基)δ'：35Kχ：15Kψ：12Kβ：40K(dnaN)—识别模板链，将酶“夹”到DNA链上。图11-23DNA聚合酶Ⅲ的成分与功能全酶在DNA上的装配分为三个阶段：（1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。（3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。二.DNA连接酶其作用机制是分三步进行：1.在真核生物中，E＋ATP→E－AMP＋ppi在E.coli中，E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）2.E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化3.活化的5’－PO4与相邻的3’－OH作用形成3’－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。三.单链结合蛋白（SSB）又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成在E.coli中以四聚存在分子量为74KDa在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。四.解旋酶(helicase)表11-3E.coli及噬菌体的解旋酶解旋酶结构功能DnaB330K六聚体结合与OriC,Oriλ参与前引发分离双链，水解ATP,提供能量。rep蛋白66K单体ATP依赖性解旋酶，在φX174滚环复制中推进复制叉PriA(w蛋白)82K单体φX174Rf形成中参与前引发体3’→5′移动取代SSB，识别特异位点。TraY/I多聚体F因子滚环复制中解链。基因4蛋白58KT7噬菌体复制中延5’→3′解链。第五节原核生物，噬菌体和病毒的复制起始和终止一.环状DNA的复制GATCTNTTNTTTTCTGGATAATTtGGATAAR1R3LMR123423628088186194231239260268R2R4AATAtGTGAAATAGGTGT13－聚体9－聚体245bp图11-27E.coli复制起点OriC的结构复制起始区的结构特点是：（1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（9－14个GATC）8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;（3）具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。复制起点具有3个13bp和4个9bp的重复顺序GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA单体结合在9bp的重复顺序上13bp9bp20～40个DnaA单体形成一个大的复合物在13bp重复顺序上DNA解链DnaB/DnaC结合成复合体，产生了复制叉DnaBDnaBDnaC图11-28前引发涉及到系列蛋白的连续装配并导致DNA的解链(引自B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997，Fig15.18)表11-4在OriC上前引发所需的六种蛋白蛋白功能对蛋白质的要求DnaA(S)协同结合于9bp和13bp重复顺序20-40单体DnaB(F,S)结合于DnaA，提供解旋酶活性1-2六聚体DnaC(F,S)和DnaB形成复合体六个单体HU组蛋白样蛋白，激发复合体形成～5个双体Gyrase旋转酶，解除正超螺旋，引入负超螺旋催化ssB(F)稳定单链化学剂量，四聚体(S):慢停突变；（F）：快停突变PR/OROricrocⅡop右向转录复制起启动子始区图11-31λ噬菌体右向转录启动子对复制起始的激活是必须的(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997，Fig19.18)表11-5在OriC和Oriλ上起始涉及相同的反应阶段OriCOriλOri的识别与解链DnaAODnaBDnaBDnaCP解旋酶的结合与解链RNApolRNApolDnaJ?DnaJ?释放复合体DnaK?DnaKGyrase?复制叉的移动SSB?引发DnaGDnaG摘自《Gene》V，1994，B.Lewin.Table19.6表11-6φχ174的复制周期阶段时间（分）行为SS→RF0－1吸附和穿透。病毒单链经复制成复制形（RF1），RF1转录。RF→SS1－2025亲代RF经复制产生60个子代RF，RF和宿主DNA的半保留复制停止。RF→SS20－3340子代RF形成35个滚环，复制出500个ss分子，包装入噬菌体颗粒，细菌裂解。1968年Gilbert提出滚环复制模型:（1）共价延伸；（2）模板链和新合成的链分开;（3）不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸（4）只有一个复制叉;（5）形成多联体（concatemer）;滚环复制的电镜照片哪些DNA进行滚环复制?真核rDNA的扩增；F因子DNA的转移；λ裂解途经的复制；φX174,M13.G4等；单链环状DNA噬菌体第二阶段复制都是进行滚环复制的。3'5'TraY/I多体在环上移动，DNA解链单链进入受体3'5'合成互补链3'5'供体的缺口被封闭受体中的DNA成环图12－38F因子DNA的转移(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997，Fig14.22)184bp23bp52bp23bp61bp5'基因1φ1.1Aφ1.1BA-T丰富区基因1.13'TTATGCTGAGTGATATCTTATGCTGAGTGATATRnaseⅢ酶切位点图11-40T7噬菌体复制起始区的结构表11-8T7DNA合成所需的酶和蛋白酶基因结构和功能RNApol198.1KDa单链，可能合成引物DNApol584KDa，ssDNA3′→5′外切活性，有的聚合酶活性，组成DNApo亚基trxA宿主基因合成12KDa，硫氧还蛋白(thioredoxin)，pol亚基解旋酶458KDa的产物三磷酸酯酶458KDa的产物引发酶466KDa的产物，识别5′GGGTC3′或5′TGGTC3′SSB2.5单链结合蛋白内切酶3降解宿主DNA用于合成5′外切酶6同上连接酶1.3封闭缺口二.DNA