多糖结构解析的方法

多糖结构解析的方法一类是传统的化学方法，一类是波谱学方法。2.1化学方法化学方法是用来对一些简单的单糖、二糖和寡糖进行分析的经典方法，同时亦可应用在多糖的结构解析上。它是通过完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和气质联用对多糖进行解析的。2.1.1水解法水解法通过完全水解将多糖链分解成单糖，这是分析多糖链组成成分的主要手段。水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。水解后的多糖经过中和、过滤可采用气相色谱、纸层析、薄层层析、高效液相色谱仪[8]和离子色谱法[9]进行分析。2.1.2高碘酸氧化法高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量进行，每裂开一个C—C键消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度和支链多糖的分枝数[10]。2.1.3Smith降解Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分水解。由于糖残基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物。根据降解产物可以推断糖苷键的位置。在降解产物中若有赤藓糖生成，则提示多糖具有1→4结合的糖苷键；若有甘油生成，则提示有1→6、1→2结合的糖苷键或有还原末端葡萄糖残基；若能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等,则有1→3糖苷键结合的存在[11]。2.1.4甲基化反应甲基化反应是用甲基化试剂将各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进而将甲基化多糖水解后得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接的位置。甲基化反应的关键在于甲基化是否完全，通常采用红外光谱法检测3500㎝-1处有无吸收峰,以此来判断甲基化多糖中是否含有游离的羟基(-OH)。甲基化的方法有Purdie法、Hamorth法、Menzies法和Hakomori法等[12]。现在使用较多的是Ciucanu和Kerek[13]方法,它是将多糖样品溶解在DMSO中,加入NaOH粉末和碘甲烷，混合在密封瓶中25℃搅拌6min即可,方法简单,重复性好。2.2波谱学方法食（药）用菌多糖由于结构比较复杂，仅用传统的化学方法完全解析多糖结构是十分困难的，必须利用波谱学知识进行解析。在食（药）用菌多糖中常用的波谱学方法有紫外分光光度计法、红外光谱法和核磁共振法。2.2.1紫外分光光度计法用苯酚硫酸法（490nm）进行多糖的含量测定;280nm处有无吸收峰来检测是否含有蛋白质和在260nm处有无吸收峰来判断是否含有核酸;在620nm处有无吸收峰来判断有无色素[14];在206nm处有无吸收峰来判断是否含有多糖[15]。2.2.2红外光谱法红外光谱分析多糖结构，可以鉴定多糖的构型，如：α构型多糖常出现844±8cm-1峰,而β构型多糖出现891±7cm-1峰。糖键上主要取代基的特征谱为分子间、内氢键使糖羟基在3600～3200cm-1处出现一宽峰，磷酸基在1300～1250cm-1处有P=O伸缩振动峰，磺酸基在1240cm-1处有S=O伸缩振动峰，酯胺在1650、1550cm-1附近出现振动吸收。吡喃糖苷在1100～1010cm-1处应有3个吸收峰，而呋喃糖苷在相应的区域只出现2个峰[16]。2.2.3核磁共振法运用核磁共振技术可以在有或没有结构背景知识的情况下获得碳水化合物最完全的结构信息，它突破了用化学方法测定多糖结构的局限性，为复杂的多糖结构解析提供了有利工具。通过综合考虑一维、二维图谱，互相验证，得到更为准确的多糖结构信息。核磁共振波谱的多糖结构分析方法介绍如下。2.2.3.1糖残基数的确定多糖是由单糖以一定的连接方式组成的重复结构单元，由一种或多种单糖组成，所以确定多糖的糖残基数是很重要的。一般来说，糖残基数是根据多糖的异头氢和异头碳来确定的。在1H4.3～5.9之间；在13CNMR谱中，异头碳的化学位移一般在NMR谱中，异头氢的化学位移在90～112之间。根据出现的信号峰来确定多糖的糖残基数。但是在1H4.3～5.9的异头氢区域，造成假象。所以于在1HNMR谱中，异头氢区域的信号不一定都是异头氢的信号，比如在O-乙酰基取代碳上的氢，虽然不是异头氢，但是其氢的化学位移会因为O-乙酰基取代而向低场移动到NMR谱和13CNMR谱中信号峰数目不一样时，还要通过1H-1HCOSY谱和1H-13CCOSY谱进行验证，进而确定多糖中的糖残基数[17]。2.2.3.2单糖构型的确定组成多糖的单糖一般可以分为呋喃糖构型和吡喃糖构型。在1H5.4左右，J1,2小于2Hz,此是呋喃糖构型区别于吡喃糖构型的主要特征[18]。在13CNMR谱中，呋喃糖构型的异头氢的化学位移在82～84之间有信号，也是区别呋喃糖构型和吡喃糖构型的主要依据～112,并且呋喃糖糖醛糖的C4和呋喃糖糖酮糖的C5在NMR谱中，异头碳的化学位移在[20]。吡喃糖构型大致又包括葡萄糖构型（葡萄糖和异鼠李糖）、甘露糖构型（甘露糖和鼠李糖）和半乳糖构型（半乳糖、岩藻糖）。葡萄糖构型可以通过J2,3,J3,4,J4,5在8～10Hz之间来判断[21]，还可以通过H2的高场化学位移的特征来判断。或者是在TOCSY谱中，具有一个H1～H6完全的自旋系统，也可以视为葡萄糖构型[22]。甘露糖构型可以通过J1，2(0～2.0Hz)非常小和J4,5(8～10Hz)大的偶合常数来确定甘露糖构型[23]。由于J3,4和J4,5较小（J3,4和J4,53Hz）,阻碍了从H1→H6的相关传递，由此可以推断半乳糖构型的存在[24]，同时H4相对于其他单糖残基而位于低场区域[26]也可作为判断半乳糖构型的依据。在TOCSY谱中只能推出H1→H4[26]和在NOESY谱中的H4与H3和H5有强的NOE效应也是半乳糖构型的主要特征[27]。2.2.3.3单糖组分化学位移的确定一般来说，可以通过1HNMR谱、1H-1HCOSY谱和TOCSY（HOHAHA）谱推出单糖上各碳上氢的化学位移，然后根据13CNMR谱和1H-13CCOSY谱（HMQC谱和HSQC谱）推出碳的化学位移。但是对于不同构型的还略微不同，比如半乳糖构型，因J3,4和J4,5较小，阻碍了交叉峰的出现，可以从1H-1HCOSY谱中的交叉峰推出H1，H2和H3。由于H3和H4在1H-1HCOSY谱中的J3,4较小，所以没有交叉峰的出现，因此H4可以通过TOCSY（或HOHAHA）谱得出，根据H1的相关交叉峰进行判断；H5可由NOESY谱得出，由于H3和H4与H5信号相关。H6可以通过1H-1HCOSY谱和TOCSY（或HOHAHA）谱得出，由于H5和H6在此谱上有交叉峰。H5和H6与H1和H4是否在同一糖环中，还可以通过HMBC谱，H1和C5相关、H5和C4相关、H6和C5相关来证明H5、H6是同一糖残基上的氢。碳的化学位移可由HMQC谱来推断，对于未被推出的，可用HMQC-TOCSY谱进行辅助，例如：H1与C1、C2、C3和C4相关，C5与H5、H6a和H6b相关，还可以通过HMBC谱进行验证，如：H1与C3、C5，H2与C1，H4与C5和C6相关等[28，29]。而甘露糖构型由于J1,2较小，所以常采用DQF-COSY谱和TOCSY谱结合来确定H的化学位移[30]。