面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程

河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第1页共11页面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程姓名：孙晓晴学号：2008011107年级：2008级专业：生物技术指导教师：边艳青2010-12-25河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第2页共11页面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程孙晓晴2008011107（河北师范大学生命科学学院生物技术专业石家庄050000）【摘要】发酵工程是生物技术的五大技术之一,是生物技术的重要组成部分,是生物技术产业化的重要环节,它是微生物学、生物化学和化学工程学有机的结合的后续课程,发酵工程实验是配合发酵工程教学开设的一门课程。根据课程特点,本学期发酵工程实验内容为模拟整个发酵过程,从菌种选育开始,经过培养基的优化,发酵过程控制,最终确定面包酵母突变株的最适生长培养基、生长规律、pH变化规律以及溶氧规律等。【关键词】面包酵母;诱变育种;培养基优化;发酵酵母生产是发酵工业的一个重要组成部分,目前世界酵母年产量约200万吨,主要应用于食品工业,面包酵母是其中最典型的一种。酵母菌通常形成球形或椭圆形,对制作面包而言椭圆形的品种为最佳,俗称真酵母菌。面包酵母是在制备焙烤产品时常用的一种添加剂,它利用面粉中可发酵性糖产生的CO2膨胀面团的体积,通过面团体积的膨胀来改良面团的组织结构并改善面包的风味。因此,选育优良的面包酵母菌种有着巨大的社会经济效益。我国在面包生产中存在的问题之一是生产周期长（一般为8-12小时）,生产效率低,与国外先进的生产方法相比,有较大差距。本实验在改良面包酵母菌种的基础上,对培养基进行优化,对发酵过程进行全面合理控制,从而进一步完善面包酵母的发酵工艺。1.材料1.1菌种面包酵母（来自边老师提供）1.2培养基1.2.1PAD培养基马铃薯（去皮）200g,切成小块,加1000mL水,煮沸1h,用双层纱布滤,取出滤液,加葡萄糖20g使其完全溶解,加水定容到1L,pH自然。若为固体培养基,则加琼脂20g/L。1.2.2发酵培养基经过2.2优化步骤选出的最优培养基配方,在文章中会介绍到。1.3试剂琼脂;葡萄糖;酵母膏;蛋白胨;(NH4)2SO4;自来水1.4器材及用具河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第3页共11页分析天平、普通光学显微镜、高压灭菌锅、震荡培养箱、恒温培养箱、培养皿、超净工作台、发酵罐、蒸汽发生器、空气压缩机等;锥形瓶、枪头（蓝、黄）、移液器、涂布棒、试管、血细胞计数板、计数器、酒精灯等。1.5发酵罐发酵罐的结构包括罐体、挡板、搅拌、空气分布系统、热交换系统、蒸汽系统等。不同的系统作用不同,且为稳定发酵条件起到重要的作用。2.试验方法本实验以小组为单位自行设计实验流程。2.1诱变选育菌种采用物理因子紫外线诱变面包酵母,DNA能够强烈吸收紫外线,尤其是碱基中的胸腺嘧啶,从而形成二聚体,改变DNA结构,引起基因突变。再筛选有利突变菌株进行培养。常用的是15瓦的低功率紫外灯,其波长集中在253.7nm,距离常用34cm,时间几十秒到几分钟不等。2.1.1培养基配制及无菌物品准备配制PAD固体培养基、液体培养基,准备培养皿、试管、9ml无菌水试管、涂布棒、枪头等包好,置于高压灭菌锅中,121℃,20min灭菌。打开超净工作台紫外灭菌30min。2.1.2制备菌悬液在超净内,取1ml菌悬液加入盛有9ml无菌水的试管中,计数。顺序依次进行10-1～10-8稀释。2.1.3涂布法接种选取上述稀释好的浓度为×10-6和×10-7的菌悬液,各吸取0.5ml涂布在固体平板培养基上,每个稀释度涂15板,保证每个固体平板培养后菌落数在30～80个,以便菌落计数和菌落形态观察。做好标记。2.1.4紫外诱变本实验设计了0s、30s、60s、90s、12s五个诱变剂量,将上述培养基分组置于超净工作台内,每个稀释度作3个平行。由于紫外线的穿透能力很差,因此要打开平皿盖,按照五个诱变剂量进行紫外照射诱变。标记。在培养箱中28℃倒置培养1～2天。河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第4页共11页诱变时间稀释度0s30s60s90s120s×10-6123×10-71232.1.5突变菌株的筛选将培养好的培养皿进行菌落计数和形态观察,找出菌落生长状态最好的平板,记下稀释度和诱变剂量。在无菌条件下挑单菌落,接液体培养基,28℃震荡培养3天,挑选生长好的菌液,4℃冰箱保存,备用。2.2正交试验设计优化培养基正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是研究多因素多水平的设计方法,它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验,这些有代表性的点具备了“均匀分散,齐整可比”的特点,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。本实验设计四因素三水平即L9(34)来筛选最优培养基配方。2.2.1根据问题和实际要求确定影响因子及影响因子水平,列出因子水平表。影响因子影响水平酵母膏蛋白胨葡萄糖pH10.5%0.5%2.0%521.5%1.5%4.0%633.0%3.0%6.0%72.2.2根据因子水平表设计正交表。No.酵母膏蛋白胨葡萄糖pH111112122231333421235223162312731328321393321对照1%1%2%6.4河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第5页共11页2.2.3根据正交实验设计表进行试验。2.2.3.1培养基配制及无菌物品准备配方基础为：酵母膏(1%);蛋白胨(1%);(NH4)2SO4(0.5%);葡萄糖(2%);pH=6.4。将上述基础药品配制成10倍母液,每种培养基配30ml,按比例加入母液。最后调pH。另按配方基础配一组培养基作为对照组。将培养基和所需用具包好,进行湿热灭菌,121℃,20min。2.2.3.2接种待培养基冷却至60℃左右时,无菌条件下,每管培养基接种1ml菌悬液。28℃摇培17h。2.2.3.3计数及级差分析将上述培养好的10种培养基的菌液稀释到合适浓度后进行计数和级差分析,筛选出最适面包酵母生长的培养基配方,作为优化培养基,用以进行发酵。2.3分批发酵河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第6页共11页2.3.1熟识发酵罐结构2.3.2发酵前准备按照最优培养基配方配制培养基：酵母膏20g、蛋白胨10g、葡萄糖40g、(NH4)2SO45g、pH=6.4。把配好的培养基倒入发酵罐中定容至12L。2.3.3分批灭菌2.3.3.1盖好罐盖,对成拧紧螺丝,温度控制改为手动控制;2.3.3.2开排气阀门402,开阀门403排夹套冷却水,关闭其他阀门;2.3.3.3开启搅拌;2.3.3.4开蒸汽阀门202,夹套进汽,待排水出口有蒸汽排出时,关小阀门403,进行培养基预热;2.3.3.5当培养基温度达到98℃时,停搅拌,开蒸汽阀门201,微开阀门401,关小阀门402;2.3.3.6调节蒸汽阀门201、202,使罐温稳定在120～124℃。开始计时;2.3.3.7取样阀灭菌,开蒸汽阀门203,半开阀门405,缓慢旋开取样阀;2.3.3.8旋松接种口盖,有少量蒸汽冒出即可。灭菌维持20～30min;2.3.3.9灭菌结束。旋紧取样阀门,关闭阀门405、203,开402、关闭401;2.3.3.10关闭蒸汽阀门202、403;河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第7页共11页2.3.3.11关闭201,当罐压接近0.05Mpa时,开空气流量计针阀,开阀门102,空气进入罐内,调节排气阀门402,控制罐压;2.3.3.12开进水阀门302、404,该温度控制为自动控制,开始冷却。冷却到设定温度,备用。2.3.4发酵罐接种接种前,用75%酒精棉球对接种口消毒,然后火焰环放置在接种口处,按10%接种量将种子液迅速倒入发酵罐内。2.3.5发酵过程监控在发酵过程中,每隔30min,记录发酵液的pH值和溶氧(Do)值,并每隔1h用试管在取样口处取样,对菌液进行计数。2.3.6结束发酵停止发酵后,对发酵液和冷却水进行放罐,仔细清洗发酵罐和电极,重新安装备用。3.结果与讨论3.1诱变育种结果由下表可以看出,经过诱变后,酵母菌的死亡率非常高,部分平板的结果甚至是100%。可能是由于计数时出现失误,经稀释后菌的浓度过低,大剂量的诱变对菌体伤害作用很大,导致死亡。只有在×10-6浓度、30s诱变剂量下出现了符合要求的突变菌株。诱变时间稀释度0s30s60s90s120s×10-6146211023900103170000×10-7119110021310003170000死亡率（%）097.798.998.91003.2正交试验设计优化培养基结果3.2.1正交结果（级差分析法）级差R的大小代表影响因素对菌体生长的影响水平大小,级差越大,说明该因素对菌体繁殖的影响越大,即为主要影响因素。根据级差R的大小确定主次因素的次序,可知四因子对菌体生长繁殖的影响程度依次为酵母膏蛋白胨pH葡萄糖。据K值的大小确定最适宜的配比,最大的K值对应最好的水平。对照组最终的菌液浓度为6.87×108个/ml，3、4、6、7、8、9组的菌液浓度均大于对照组。因此,本组的最适培养基配方组成为：酵母膏3%、蛋白胨3%、葡萄糖4%、pH=5（如下表所示）。河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第8页共11页No.酵母膏蛋白胨葡萄糖pH菌液浓度（×108个/ml）111114212226.57313337.5421238522316.25623128.75731328832138.29332112K16.086.676.986.75K27.676.617.777.77K399.427.257.9级差R2.982.750.781.153.2.2各影响因子的影响趋势3.2.2.1酵母膏不同含量酵母膏的K值变化6.087.67902468100.51.53酵母膏（%）K值根据K值的变化趋势，可以看出酵母膏含量越大，k值越大，即菌体生长越旺盛。且K值有继续增大的趋势，说明还可以增大培养基中酵母膏的含量。河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第9页共11页3.2.2.2蛋白胨不同含量蛋白胨的K值变化6.676.619.4202468100.51.53蛋白胨（%）K值3.2.2.3葡萄糖不同含量葡萄糖的K值变化6.987.777.256.577.58246葡萄糖（%）K值3.2.2.4pH不同pH的K值的变化6.757.777.966.577.58567pHK值由K值的变化趋势可以看出，蛋白胨含量在0.5%～1.5%范围内时，菌体繁殖速率缓慢；在1.5%～3%范围内，随着蛋白胨含量的增加，菌的生长水平也越来也好。按照该趋势，还可以继续增加蛋白胨的含量。根据K值大变化趋势可以看出，葡萄糖含量在2%～4%范围内，随着葡萄糖含量的增多，酵母菌生长越旺盛；而在4%～6%范围内，酵母菌的生长速度则随着葡萄糖含量的增多而下降。说明4%是葡萄糖的最好水平。由图可以看出，K值随着pH的增大而逐渐增大，在6～7范围内趋势变缓。即酵母菌的生长随pH的增大而越来越旺盛。该结果与实际酵母菌在其生长最适pH范围的生长趋势不符，可能是由于培养基中糖含量高造成的。河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010年12月25日第10页共11页3.3分批发酵结果周期菌数(个/ml)pHDo(%)0h4.825×1066.091000.5h5.5×1066.0183.31.0h——5.9479.41.5h7.4×1065.8779.4