基因克隆实验手册

基因克隆实验手册目录cDNA合成核酸纯化琼脂糖凝胶电泳基本的连接反应～定向克隆限制性内切酶／连接反应TA克隆In-Fusion克隆基因克隆实验（操作流程）基因克隆实验手册—1—基因克隆实验指南基因克隆操作的基本流程T载体TT3’AA3’5’GATCTCGA5’线性化载体CTAGAGCT5×In-Fusion®HDEnzymePremixIn-Fusion酶使末端15个相同碱基无缝融合totalRNAmRNA基因组DNA等反转录反应cDNA合成【目的DNA片段】使用In-Fusion引物获得的PCR扩增产物【目的DNA片段】扩增产物末端附加有“dA”【目的DNA片段】带有限制性内切酶的酶切末端PCR限制性内切酶处理、DNA修饰（附加接头、末端平滑化、定向等）琼脂糖凝胶电泳确认转化·感受态细胞形成菌落进行菌落PCR确认插入片段·EmeraldAmp®MAXPCRMasterMix等·电泳相关制品培养纯化质粒DNA·TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0等目的DNA的解析·测序·蛋白表达·基因导入·重组病毒制作Translation等·PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶回收、或必要时进行去磷酸化反应将目的DNA片段（靶序列）插入到任意载体中的基因克隆操作是基因工程实验的基本技术之一，目前也广泛应用于各种研究领域中。限制性内切酶的发现和应用使基因克隆成为一种广泛性的实验手法，但近年来无需使用限制性内切酶处理的TA克隆法及In-Fusion法的开发可随心所欲的进行基因克隆。另外，基因克隆时，从检测样品中提取和纯化基因组DNA及RNA、mRNA的反转录反应合成cDNA、PCR反应扩增DNA片段等也是获得目的DNA的非常重要的操作环节。本实验手册对使用限制性内切酶的传统克隆法、广泛使用的TA克隆法及最新克隆法In-Fusion克隆进行基因克隆时所必需的各种实验操作（DNA纯化、cDNA合成、菌落PCR等）的操作方法概要进行介绍。【克隆实验手册】中所记载的内容对基因克隆初学者和具有一定经验的研究人员会有所帮助，希望大家随时使用。cDNA文库DNA片段In-Fusion克隆TA克隆限制性内切酶/连接invitro※※HindⅢBamHⅠ※※—2—克隆方法插入DNA片段的末端形状载体制备限制性内切酶/连接TA克隆In-Fusion克隆■根据使用目的推荐的克隆用试剂盒■制备插入DNA片段和载体实验目的推荐使用的试剂盒快速·高效率地连接DNALigationKitMightyMixIn-Fusion®HDCloningKitBluntingKinationLigation(BKL)KitMightyTA-cloningKitMightyTA-cloningReagentSetforPrimeSTAR®TaKaRaDNALigationKitLONG想快速、高效地进行基因克隆产品信息P4P6P6P6P8P4无缝融合相同序列后，可简单的进行目的基因的PCR片段的克隆想进行连接反应想进行TA克隆TTT载体3’A插入片段A3’插入片段线性化载体线性化载体·可在任意载体的任何位点插入DNA片段·不附加任何多余序列·In-Fusion反应仅需15分钟·克隆效率高·可插入几个DNA片段及长链DNA片段需要在DNA片段的两端形成限制性内切酶识位点。利用不同的限制性内切酶的酶切位点可决定插入DNA片段的插入方向。根据DNA片段的两末端进行相应的限制性内切酶处理。酶切后必要时进行纯化及去磷酸化处理。可使用任意载体。仅需限制性内切酶处理或PCR扩增使载体线性化。利用市面上销售的3’末端附加有dT的载体。使用3’端附加“dA”的PCR酶进行PCR反应、或需要在平滑末端的扩增产物中进行“dA”加尾反应。不能决定插入片段的插入方向。利用在引物末端附加与载体末端相同的15个碱基序列进行目的基因的扩增。平滑末端的连接插入片段的3’端附加有“dA”碱基插入片段为平滑末端需要附加dA碱基大片段插入片段（＞10kb）的连接插入片段想一次克隆多个DNA片段想进行定性克隆想在没有酶切位点的位置插入DNA片段因为是表达载体，不想附加多余碱基序列基因克隆实验手册BamHⅠHindⅢ利用限制性内切酶／连接进行基因克隆将目的DNA片段插入到目的载体质粒的基因克隆操作是基因工程实验的基本操作方法。这里对使用限制性内切酶和T4DNA连接酶（DNALigationKit）的基因克隆操作进行说明。操作方法概要1.准备插入DNA片段（制备目的DNA片段）(a)使用限制性内切酶切割DNA片段(b)PCR反应扩增DNA片段例：使用限制性内切酶dⅢ和HⅠ进行双酶切①配制反应液↓②37℃反应1小时↓③取一半反应液（10μl左右）加入LoadingBuffer后进行琼脂糖凝胶电泳，确认酶切反应。↓④切胶回收目的DNA片段。　为避免DNA的损伤，减少UV照射时间。使用TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKitVer.4.0等进行PCR扩增产物的纯化（参考第10页）。↓⑤使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0纯化切胶回收的DNA（切胶回收DNA的操作方法请参考第10页）↓⑥回收液作为插入DNA片段溶液［A］。↓④37℃反应1小时↓⑤使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0等纯化回收（参考第10页）。↓⑥回收液作为插入DNA片段溶液［A］。使用TakaraCut-SiteNavigator（下一页）非常方便。底物DNA(≤1μg)1μl1μl10×KBuffer2μl灭菌水upto20μl(轻弹混合)去磷酸化处理（防止自连）↓37～65℃反应30分钟苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）提取（2次）氯仿/异戊醇（24：1）提取（1次）乙醇沉淀溶解于TEBuffer（20μl以下），作为质粒DNA溶液［B］。↓↓↓↓限制性内切酶处理后的载体1～20pmolAlkalinePhosphatase(BAP)0.3～0.6U10×AlkalinePhosphataseBuffer5μl灭菌水upto50μl2.准备载体质粒①使用限制性内切酶在目的载体质粒（环状）的克隆位点进行酶切反应【载体的线性化】↓②37℃反应1小时↓③使用TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKitVer.4.0等纯化反应液（参考第10页）。↓④回收液作为质粒DNA溶液［B］。TksGflex®DNAPolymerase使用例①PCR↓②PCR扩增产物的纯化限制性内切酶酶切位点＋5’端3个以上碱基2×GflexPCRBuffer(Mg2+,dNTPplus)25μlForwardPrimer0.2～0.3μM(finalconc.)ReversePrimer0.2～0.3μM(finalconc.)模板DNA500ngTksGflexDNAPolymerase1.25U灭菌水upto50μl94℃1min.　　↓98℃10sec.60℃15sec.68℃30sec./kb↓③利用限制性内切酶酶切反应对PCR扩增产物的两端进行酶切处理（必要时可增加反应体积）30cycles首先确认目的DNA片段的限制性内切酶的酶切位点，然后根据载体质粒的克隆位点选择限制性内切酶。利用与载体连接的限制性内切酶酶切位点的5’端附加的引物进行插入DNA片段的PCR扩增。(轻弹混合)上述纯化后的PCR产物≤2μl1μl1μl10×KBuffer2μl灭菌水upto20μl(轻弹混合)载体质粒DNA(≤1μg)1μl1μl10×KBuffer2μl灭菌水upto20μl(轻弹混合)(轻弹混合)使用一种限制性内切酶制备插入DNA片段和载体质粒的线性化时，为避免载体的自连应进行下面的载体的去磷酸化处理。5'-端突出末端的去磷酸化处理使用CIAP（CalfIntestinalAlkalinePhosphatase）即可，平滑末端及3’-端突出末端的去磷酸化处理建议使用BAP（BacterialAlkalinePhosphatase）。基因克隆实验手册—3—HinBamHindⅢBamHⅠ※HindⅢBamHⅠHindⅢBamHⅠ—4—基因克隆实验手册3.插入DNA片段与线性化质粒的连接使用DNALigationKit〈MightyMix〉时使用HST08PremiumCompetentCells时↓　16℃、反应30分钟（或25℃反应5分钟）①使用前在冰上将100μlHST08感受态细胞融化后轻轻混合，移至14ml圆底Tube中（不可振荡混合）。↓②加入10μl连接反应后的反应液、在冰中放置30分钟↓③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟↓④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1ml。↓⑤37℃振荡培养1小时（160～225rpm）↓⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养插入DNA片段溶液质粒DNA溶液[B][A]50ng(25fmol)25～250fmolLigationMix7.5μl灭菌水upto15μl4.转化5.PCR扩增确认插入片段DNA6.培养、纯化质粒PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页TaKaRaBio网站上的限制性内切酶识别序列检索工具只要输入DNA碱基序列，即可显示切断位点及模式图和详细的碱基序列。【关联产品】【Q1】难以连接，转化效率低时的注意点有哪些？【A1】【Q2】长链DNA克隆时的注意点有哪些？【A2】常见问题产品名AlkalinePhosphatase(C75)HIAlkalinePhosphatase(Calfintestine)TksGflex®DNAPolymeraseTaKaRaDNALigationKitLONGDNALigationKitVer.2.1TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKitVer.4.0TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0AgaroseRegularλ-dIIIdigestDNALigationKitMightyMix100bpDNALadder(DyePlus)包装量10,000U10,000U50U1,000U250U1Kit1Kit1Kit(100次)1Set(100μl×10)1Set(100μl×10)50次量50次量50次量50g100次量100μg限制性内切酶、去磷酸化处理PCR连接、转化纯化DNACodeNo.1060A1010A2120A2250AR060A6023602260249128905297619762976052603422A3905302604202,000500500630400300350350350300360价格(元)TakaraCut-SiteNavigator·请延长连接反应时间。·DNA溶液的盐浓度偏高会导致连接效率下降。特别是乙醇沉淀时使用的醋酸铵对连接反应有抑制作用，乙醇沉淀时要充分清洗，进行除盐处理。·使用DNA提取试剂盒时，对提取液进行乙醇沉淀后交换缓冲液可提高连接效率。·进行突出末端的连接时，将DNA溶液（载体+插入片段DNA）在60～65℃加热2～3分钟后冰中急冷，再加入LigationKit中的各试剂进行连接反应。确保突出末端的连接可提高转化效率。以上操作不能改善连接效率时建议进重新纯化DNA。DNA链越长，连接效率越低。TaKaRaDNALigationKitLONG（CodeNo.6024）最适用于长链DNA片段的连接，对10kb以上的长片段DNA的连接特别有效。另外，连接有插入DNA片段的较大质粒（