菌种筛选方法

菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。1从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicilliumurticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberellafujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。2平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图5.6.1平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起形态大小测定的偏差。1)纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。2)变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。3)透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。4)生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。5)抑制圈法待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避免各菌落所产生抗生素的相互干扰。典型的例子是春雷霉素生产菌的筛选，见图5.6.2。3摇瓶培养法摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。4特殊变异菌的筛选方法上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的，为了从存活的每毫升106左右细胞的菌悬液中筛选出几株高产菌株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。虽然平皿快速检测法作为初筛手段可减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的工作仍然非常繁重。而且有些高产变异的频率很低，在几百个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建立特殊的筛选方法是极其重要的。例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分离的筛子，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在DNA中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。本节还将简单介绍其它一些特殊变异株的筛选方法。4.1营养缺陷型突变株的筛选经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。1)浓缩营养缺陷型菌株诱变后的细胞群体中大部分存活菌是野生型，而营养缺陷型占的比例相当小，这对分离是很不利的，所以，应该淘汰大量的野生型，以达到浓缩营养缺陷型的目的。常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。2)进一步检出所需缺陷型浓缩后的菌液中营养缺陷型的比例较大，但并非全部都是。并且营养缺陷型中也有不同的类型，还需要进一步检出所需要的营养缺陷型。这样就需要采用逐个检出法、夹层培养法和限量补给法等方法进一步检出所需要的营养缺陷型。3)营养缺陷型的鉴定获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。菌株较少时，可用生长谱法，若菌株较多时，常采用组合补充培养基法4.2抗性突变菌株的筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。1)一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。2)阶梯性筛选法药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来一次性筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经驯化或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下4.3组成酶变异株的筛选许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。这些都可能造成这些水解酶工业生产的波动以及生产成本提高。如果控制这些酶合成的调节基因发生了变异，诱导酶就可能转变成组成酶，它的合成与细胞的其它组织蛋白一样，不再需要诱导物的存在。由诱导型的出发菌株诱变筛选出组成型变异株对于水解酶的工业生产具有重要的现实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。1)恒化器法恒化器常被用于微生物的驯化。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，接入处理后的菌悬液进行培养，此时出发菌株由于不能被诱导，无法合成有关的诱导酶而不能分解该底物，从而生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。2)循环培养法利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。进而将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步了，随着循环交替培养的继续，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。3)诱导抑制剂法有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷对大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的诱导合成有抑制作用，称为诱导抑制剂。当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。4.4高分子废弃物分解菌的筛选随着石油化工和塑料工业的发展，各种高分子包装废弃物日益增多，这些白色污染在自然界很难被消化而进入物质循环。设法选育能分解利用这些高分子材料的微生物对于环境保护至关重要。这些高分子材料大多是不溶于水的，直接分离具有分解功能的微生物很困难。为此，有人设计了阶段式筛选法，首先寻找能在与聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇上生长的微生物，接着，诱变筛选能分解聚乙二醇的变异株；或者筛选能以乙二醇、丙二醇为碳源的菌株，继而诱变筛选出能利用聚乙二醇等物质的变异株。这种由简单的聚合物单体入手逐级筛选高分子废弃物分解菌也许是一条有效的筛选思路。4.5无泡沫菌株及高凝聚性菌株的筛选有些菌在发酵过程中会产生大量的泡沫，从而造成发酵液满溢，增大了染菌的机会，使发酵体系反应不均匀，也有可能引起某些发酵产物的生物活性丧失，如蛋白酶变性失活。为了避免泡沫的产生，常常需通过牺牲发酵液的装量或加入大量的消泡剂来消除泡沫的不利影响。发酵过程产生泡沫是菌体代谢、培养基和发酵工艺等方面的原因造成的，而菌种是产生泡沫的关键，选育无泡沫或少泡沫菌株可以从根本上解决