抗氧化活性实验方法

抗氧化活性实验方法（体外实验）1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mLDPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH1201100%AAA清除率A0—2mL无水乙醇+2mLDPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+2mLDPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+2mL无水乙醇的吸光值。2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/LpH6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5mL1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mLFeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe2+1201100%AAA螯合率A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A1—样品溶液反应后的吸光值；A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。4、超氧自由基（O2-）清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL8mmol/LHCl终止反应，于299nm处测定吸光度（Ax），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。按下式计算O2-清除率：O2-00100%xAAA清除率A0—空白对照液吸光度；Ax—样品溶液吸光度。5、羟自由基（•OH）清除率的测定利用H2O2与Fe2+混合产生•OH，在体系中加入水杨酸捕捉•OH并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/LH2O21mL、9mmol/LFeSO41mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样品溶液1mL。最后加H2O2启动反应，37℃反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值，以9mmol/LFeSO41mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值。按下式计算•OH清除率：•OH001100%xxAAA清除率A0—空白对照液的吸光度；Ax—加入样品溶液后的吸光度；Ax0—不加显色剂H2O2样品溶液本底的吸光度。