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思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用凝胶的分子筛作用，来进行分离。2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长,移动速度较慢。分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短,移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。大分子通过凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子2、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得不同PH范围内使用的缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO31、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。㈡缓冲溶液：1）原理：在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子（蛋白质，ＤＮＡ等）的分离。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷㈢电泳：电荷性质电荷量分子形状分子大小聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳2、常见方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素②原理③SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量①应用电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）两个a－肽链两个β一肽链样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定共四条肽链90％①目的：去除（）②方法：每个肽链环绕一个亚铁血红素基团。此基团可携带O2或CO2。血红蛋白因含有血红素而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。为何不用鸡血？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。(1)红细胞的洗涤杂质蛋白(2)血红蛋白的释放加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯（溶解细胞膜），置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：试管的溶液分为4层:第1层（最上层）：（）甲苯层第2层（中上层）：（）的沉淀层，（）色薄层固体第3层（中下层）：（）的水溶液层（）的液体第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。(4)透析思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：⑤安装其他附属结构。③顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择：（）（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）。蒸馏水凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶①固定：将色谱柱处置固定在支架上②装填：将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液色谱柱注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。50cm3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面②加透析样品①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用（）将1ml（）的样品加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待（）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集注意正确的加样操作：①不要触及破坏凝胶面②贴壁加样③使吸管管口沿管壁环绕移动吸管透析液顶端样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。纯化