溶血性贫血实验室检查

溶血性贫血的实验室检查Laboratorydiagnosisofhemolyticanemia本章提纲一、溶血性贫血定义和分类二、溶血性贫血的确诊试验三、溶血性贫血原因的实验室检查贫血外周血中单位容积内红细胞计数、血红蛋白含量或红细胞比容（Hct）低于正常下限。症状:疲乏困倦；气促；心悸；食欲差，腹帐、便秘；头晕、眼花，嗜睡，精力不集中体征：皮肤黏膜苍白；黄疸；肝脾肿大贫血失血性贫血缺铁性贫血巨幼细胞性贫血再生障碍性贫血溶血性贫血溶血性贫血：各种原因使红细胞生存时间缩短，破坏增多，骨髓造血代偿不足时发生的一类贫血红细胞破坏增加红细胞代偿性增加溶血：红细胞非自然衰老而提前遭受破坏的过程。溶血性疾病：发生溶血而骨髓能够代偿，未出现贫血。溶血性贫血：溶血程度超过造血代偿能力，出现贫血。定义溶血性贫血的分类１．根据红细胞破坏的场所：血管内溶血：在血流中被破坏获得性因素和酶缺陷血管外溶血：在单核-巨噬系统中被破坏膜缺陷、珠蛋白异常、脾功亢进原位溶血：在骨髓中被破坏巨幼细胞贫血、急性白血病溶血性贫血的分类２．根据发生机制：代表疾病膜酶血红蛋白红细胞内在缺陷遗传性球形红细胞增多症遗传性椭圆形红细胞增多症G6PD缺陷症PK缺陷症珠蛋白生成障碍性贫血异常血红蛋白病溶血性贫血的分类红细胞外在因素损伤免疫因素非免疫因素AIHACASPCH药物诱发的免疫性溶贫新生儿同种免疫性溶贫溶血性输血反应PNH微血管病性溶血性贫血心源性溶血性贫血行军性血红蛋白尿症砷化物、硝基苯、苯肼、蛇毒等中毒溶血性链球菌、疟原虫、产气荚膜杆菌等感染（一）显示红细胞破坏增加的依据1红细胞寿命缩短、破坏增加的检验红细胞寿命测定；红细胞形态改变；血浆LDH测定2血红蛋白代谢的检验血浆游离血红蛋白测定(40mg/L)；血管内溶血的指征血清结合珠蛋白测定(500-1500mg/L)；肝脏合成的α2糖蛋白，运输游离血红蛋白血浆高铁血红素白蛋白试验；不敏感，见于严重血管内溶血（二）显示红细胞代偿增生依据外周血网织红增多；外周血红细胞形态：大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cabot环、点彩红细胞等增生性贫血骨髓象：增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨核系一般正常（二）显示红细胞代偿增生依据外周血红细胞形态：大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cabot环、点彩红细胞等Howell-Jolly小体Cabot环特点1.遗传性溶血性贫血常有贫血、黄疸、脾肿大的家族史2.某些溶贫呈一定的地域性分布3.化学因素所致常和患者所从事的职业有关4.多种药物都可致溶贫5.长期反复贫血和黄疸见于遗传性溶贫，自身免疫性溶血性贫血亦常表现为时重时轻6.恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和SLE易并发AIHA，人工心脏瓣膜置换术后常易致继发性红细胞破碎综合征溶贫的实验室诊断1.确定是否为溶血性贫血2.确定主要的溶血部位是血管内还是血管外3.查找溶血原因，明确诊断Hb代谢示意图珠蛋白血红素铁+卟啉单核巨噬系统脾脏血管外溶血RBC血管内溶血血浆游离Hb肾脏血红蛋白尿游离胆红素肝脏结合珠蛋白近曲小管上皮细胞肾阈结合胆红素粪胆原的肠肝循环含铁血黄素尿Rous实验胆汁粪胆原肠道血液肾脏尿胆原高铁血红蛋白清蛋白/血红素蛋白检查一．溶血性贫血的筛查检测１．血浆游离血红蛋白测定参考值0-40mg/L意义：见于血管內溶血２．血清结合珠蛋白检测参考值0.5-1.5g/L意义：见于血管內溶血及严重的血管外溶血３．血浆高铁血红素清蛋白检测正常结果：阴性意义：阳性见于严重血管內溶血４．含铁血黄素尿试验（Rous试验）血红蛋白在肾小管上皮细胞代谢为含铁血黄素，脱落后铁染色法查出正常结果：阴性意义：阳性见于慢性血管内溶血５．红细胞寿命测定正常红细胞半衰期为２５～３２天．溶血性贫血時常＜１５天．溶血原因分析的有关检验一、红细胞膜缺陷的检验二、红细胞内酶缺陷的检验三、珠蛋白合成异常的检验四、自身免疫性溶血的检验五、阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关检测一、红细胞膜缺陷的检测（一）红细胞渗透脆性试验（erythrocyteosmoticfragilitytest)目的：了解红细胞的渗透脆性（即抵抗力）原理：低渗溶液红细胞皱缩红细胞膨胀甚至破裂高渗溶液等渗溶液正常低渗溶液—红细胞对低渗溶液的抵抗能力0.6-0.8%NaCl溶液——红细胞不破裂0.42-0.45%NaCl溶液——部分红细胞破裂0.35-0.30%NaCl溶液——红细胞完全破裂NaCl0.85%0.6%0.42%0.35%0.8%0.7%对低渗溶液抵抗能力减小即RBC渗透脆性增加脆性增高：遗传球（椭）、AIHA伴球形细胞增多（在0.52或0.72开始溶)。脆性减低:各型地中海贫血、缺铁性贫血、肝硬化及阻塞性黄疸等。结果：正常人开始溶血0.4２～0.4６%，完全溶血0.28～0.32%（患者与对照相差0.04%以上即为阳性）。（二）红细胞孵育渗透脆性试验（erythrocyteincubatedosmoticfragilitytest)原理：红细胞在37C孵育过程中，葡萄糖消耗增加，ATP贮备减少，钠泵受阻，钠离子在胞内聚集，红细胞膨胀破裂参考值：未孵育50%溶血4.00-4.45g/LNaCl溶液37C孵育50%溶血4.65-5.90g/LNaCl溶液临床意义：用于轻型遗传性球形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶贫的诊断和鉴别诊断（三）自身溶血试验（及纠正试验）（autohemolysisandcorrectiontest)原理：先天性非球形细胞溶血性贫血病人红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，生成ATP不足，不能维持钠泵，导致溶血增强。加入葡萄糖或ATP，观察溶血能否被纠正。参考值：正常人红细胞孵育48h小时后，溶血度3.5%；加入葡萄糖或ATP后明显纠正，溶血度1%加等渗盐水加葡萄糖加ATP正常2.0（0.2—4.0）0.3（0.1—0.6）0.2（0.1-0.8）遗传性球形红细胞增多症16.0（6—30）3.0（0.2—14）3.0（1—6）非球形细胞性贫血I型3.0（1—6）2.0（0.5—4.0）1.0（0.4-2.0）II型13.0（8—44）15（4—48）1.0（0.2-2.0）I型：G6PD缺乏症；II型：丙酮酸激酶缺陷症自身溶血试验及纠正试验结果（溶血%）二、红细胞酶缺陷的检测葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症蚕豆病：患者多为儿童，在每年3-5月蚕豆成熟季节发病。起病急，在食新鲜蚕豆几小时至几天突然发作。表现为急性溶血伴有血红蛋白尿，治疗以输血、防治急性肾功能衰竭及肾上腺皮质激素为主。(一)高铁血红蛋白还原试验正常时亚铁Hb经亚硝酸盐氧化成高铁Hb，当红细胞内G6-PD含量正常时，HbFe+++可以还原为Fe++(红色)；G6-PD缺乏时，HbFe+++则不能还原为Fe++(褐色)，通过颜色变化来间接测知G6-PD含量是否缺乏。目的：该试验用来了解G-6PD活性，是一种间接的方法。红细胞对Glu的代谢有2个途径1、无氧糖酵解(90%)2、戊糖旁路途径(5-10%)原理：G6PD高铁Hb还原酶G6PG6-PANADPNADPH还原型美兰氧化型美兰高铁Hb（Fe3+）为褐色氧合HB（Fe2+）红色结果：光电比色法，正常还原率＞75%，低于75%为异常，提示G6PD活力↓，74～31%为G-6PD缺乏的杂合子（红棕色），30%以下为显著缺陷的纯合子（为棕色—目测比色法）。（二）氰化物-抗坏血酸盐试验原理:6-磷酸葡萄糖NADPGSHH202氧合血红蛋白6-磷酸葡萄糖酸NADPHGSSGH20高铁血红蛋白结果:正常人标本呈红色临床意义:1.纯合子G6PD缺乏经1-3h温育后,变为棕色2.杂合子标本3-4h变成棕红色G-6PD（三）变性珠蛋白小体生成试验又称“红细胞包涵体”、“赫恩小体”、“Heinz小体”、“海因小体”原理：G-6PD缺乏及不稳定Hb病患者Hb易被氧化，其珠蛋白变性沉着于红细胞膜上。抗凝血+乙酰苯肼37℃温育2～4h充分的氧化其Hb氧化成Heinz小体（用结晶紫、甲紫或煌焦油兰染色，油镜观察）1.正常人＜30%2.G6P缺陷症、不稳定Hb、HbH病等常高于45%结果：该小体为圆形或多角形色涵体，φ0.2～2um。多位于红细胞边缘，一个红细胞含1～20个，多为1～2个，以含5个以上小体的红细胞计数（四）G6PD荧光斑点试验和活性测定原理:G6PD使NADP还原成NADPH,后者在紫外线照射下发出荧光参考值：正常人强荧光；酶活性5U/gHb6-磷酸葡萄糖NADPGSHH202氧合血红蛋白6-磷酸葡萄糖酸NADPHGSSGH20高铁血红蛋白G-6PD三、珠蛋白合成异常的检测血红蛋白的结构原卟啉血红素Hb（四聚体）铁2条α链珠蛋白：由4条多肽链组成2条非α链正常人HbA（22）97%HbA2（22）1.5-3%HbF（22）0.5-0.8%血红蛋白病珠蛋白肽链量的不正常(地中海贫血)血红蛋白分子结构异常(异常血红蛋白病)遗传性溶血性疾病(一)血红蛋白电泳蛋白质的两性性质—是由氨基酸的NH+与COO-决定的。等电点—调节水溶液的pH，能使蛋白质的NH+与COO-数目相等呈电中性，此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。电泳：一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。原理：在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。由于各种Hb珠蛋白肽链结构不同，其等电点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电泳扫描，可进行Hb定量分析。(+)HJKAGDE(-)1.HbH增多是HbH病，为α-地中海贫血的一种；HbA2明显增高见于轻型β地中海贫血；HbF明显增高见于中重型β地中海贫血。2.正常值：醋纤法（PH8.6）HbA96%~98%，HbA21.0%~3.1%，HbF＜2%电泳结果CAA2FA异常正常（二）HbF（22）酸洗脱试验：含HbF红细胞着色（三）HbF定量测定（碱变性试验）:2岁-成人HbF2%，4%为异常，重型地贫30-90%，遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合症100%（四）HbA2定量测定诊断轻型地贫的重要依据（五）限制性内切酶谱分析四、自身免疫性溶血性贫血检验自身免疫性溶血性贫血（autoimmunehemolyticanemia,AIHA)1.病因：抗红细胞自身抗体的产生机制尚未阐明，有以下的解释：病毒感染可激活多克隆B细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变其抗原性，导致自身抗体产生2.分类：本病可为原发性的，也可继发于结缔组织病、造血系统肿瘤、感染等。按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红蛋白尿（一）Coombs试验（抗人球蛋白试验）原理：不完全抗体(IgG)，无法架接两个邻近的红细胞，而只能和一个红细胞抗原相结合。抗人球蛋白抗体是完全抗体,可与多个不完全抗体的Fc段相结合,导致红细胞凝集现象,称为抗人球蛋白试验阳性。目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全抗体，用于诊断AIHA。直接CoombsTest(+)说明病人RBC表面上包被有不完全抗体间接CoombsTest(+)则说明病人血清中存在着不完全抗体Coombs血清（抗人球蛋白血清）（一）直接试验１．正常人：阴性２．直接反应阳性，最常见于AIHA（其他有药物诱发的溶贫、阵发性冷性Hb尿、新生儿同种免疫溶血病、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。目的：测定吸附于红细胞表面的不完全抗体方法：结果：（二）间接试验有过剩抗体时直接、间接均为阳性。AIHA分三型：C3型12%，IgG型24%，IgG+C3型60%。冷凝集素病为IgM抗体。目的：测定血清中游离的不完全抗体方法：结果：间接阳性，见于AIHA，正常人为阴性。病人血清正常RBC抗IgG(二)冷凝集素试验：冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身红细胞、“O”型红细胞