RhD(-)血型的研究进展

RhD(-)血型的研究进展合肥市红十字会中心血站吕蓉2008-5RH血型的研究历史19世纪40年代发现了人类红细胞RH血型19世纪60年代,发现了RH血型不合的有效治疗方法19世纪80年代,成功分离了RH蛋白19世纪90年代,认识了RH基因结构20世纪90年代,清楚了RHD和RHCE的氨基酸序列RH血型系统的发现1940年,发现多数人红细胞上有一种血型抗原物质,与恒河猴（Rhesusmonkey)红细胞的抗原物质是相同的.1940年还发现,三例ABO血型相同，同种输血后却发生了严重的输血反应.同一年，一名O型孕妇产后大出血，输入O型丈夫的血液后发生了溶血性输血反应，这是人类由于妊娠产生的同种免疫作用的第一例报告这就表明除ABO血型系统外,还存在另外的血型系统.RH血型系统的命名“Rh”是根据恒河猴英语单词的前两位字母而由来我们现在通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性RH系统还有C、c、E、e四种抗原，也有用1、2、3、4、5来表示，D+红细胞有用RH1表示，而D-细胞用RH-1来表示，相应的等位基因用R1和R-1来表示RH血型的意义临床意义很大!RH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有,比率为0.3%左右,在欧美等白种人中,比例较高为15%左右.RH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应,母子RH血型不合的妊娠有可能发生新生儿溶血病,严重者可导致新生儿死亡,或是使胎儿死于子宫内.RH血型的检查和ABO血型同等重要,已被列为血型的常规检查之一.RH血型是如何遗传的?RH(-)基因是隐性基因.当RH阳性的父母都带有RH阴性基因,且同时遗传给后代时,其后代即表现为RH阴性.当双亲中有一人是RH(-)时,其子女为RH(-)的机会增大.RHD(-)有何意义?正常RH阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RH阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RH阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就发生严重的输血反应甚至造成死亡.RH阴性的妇女怀有RH阳性的胎儿,胎儿的红细胞就会刺激母体产生抗-D抗体,当再次怀有RHD阳性的胎儿时,就会导致新生儿溶血性贫血而死亡.RHD(-)者如何自我保护?RH阴性者在任何情况下都不能输入RH阳性的血液，必须输注相同的RH阴性血，以免由于RH不合而发生输血反应。80%的RH阴性病人在输入200MLD阳性红细胞后,在2-5个月后,血浆中可检测到抗体.RH阴性的妇女应注意婚后避免流产，保证第一胎正常分娩，以防发生RH新生儿溶血病。有资料统计14.3%的多次妊娠的D阴性孕妇产生抗-D抗体，导致新生儿溶血病。血站为RHD(-)者做哪些工作?常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者对有流产史的RH阴性的妇女，在妊娠初期做一些关于RH血型系统的产前免疫检查。一旦发生RH新生儿溶血病，在新生儿刚生下来就要立即用RH阴性的同型血液进行换血治疗，挽救新生儿的生命。表型与D抗原Rh阳性和Rh阴性弱D和部分D（弱D表现型）D放散型（Del、DEL）弱D型(WeakD)血清学表现为盐水介质阴性,IAT检测为阳性.D抗原数量的减少,但抗原表位数目基本不变.Ｄ抗原的质量不变．碱基突变形成，改变的氨基酸位于细胞膜层的中间或细胞膜层内．部分D(PartialD)红细胞缺少某些（部份）ＲＨＤ的抗原表位．与正常Ｄ抗原相比，抗原的质量发生了变化.(正常红细胞上Ｄ抗原包含３０个表位）形成原因：Ｄ基因单或多核苷酸碱基取代、ＲＨＤ－ＣＥ杂交基因。所改变的氨基酸位于ＲＨ抗原分子的细胞膜外部分．.部分Ｄ的危险在哪？许多部分Ｄ的红细胞与抗－Ｄ直接反应，但有些需要用ＩＡＴ才能鉴定，细胞的反应强度不一样，取决于试剂的制造商．部分Ｄ的个体是可以产生抗－Ｄ，因此必须接收Ｄ－的血液，在日常工作中许多部分Ｄ都被定为Ｄ＋，往往在产生抗体以后才被发现．DEL型(D放散型)盐水介质阴性,IAT检测阴性,但吸收放散试验阳性.红细胞上D抗原数目比弱Ｄ还要少,红细胞上D抗原的质量也有变化的某些ＤＥＬ型红细胞Ｄ抗原缺失某些表位，可以产生抗Ｄ抗体．.第九外显子碱基突变形成.典型的Ｄ抗原密度比较抗原型别红细胞上Ｄ抗原数正常Ｄ阳性个体10.000-30.000部分Ｄ型个体８３００WeakD型个体３０－６０００DEL型个体＜３０RHD基因进化RHAGRHceRHce和RHce复制体RHCE基因和RHD基因RHD基因的进化RHD基因的祖先基因是Rh相关糖蛋白基因(RHAG基因),该蛋白有一条N多糖链.RHAG和RHD、RHCE有38%的同源性，在红细胞上具有相同的拓扑结构，由位于6号染色体上的单个基因编码。RHAG不具有多态性，所以它不携带血型抗原，但是它对RHD和RHCE定向到膜上有重要作用。没有RHAG，RHCE和RHD都不能表达到红细胞膜上.在红系的分化中先表达RHAG,然后表达RHCE,再表达RHD.RHAG基因首先复制形成Rhce基因,第二次复制发生在同一染色体短臂,形成“Rhce复制体”,随后Rhce基因和其复制体沿不同的途径进化,最终形成现今人类的RHD基因,而RHce基因经过突变或与RHD基因发生交换形成常见的RhceRHcERHCeRHCE基因.RhD基因结构RH基因结构目前已确定:位于染色体1p34.3-36.1,主要由RHD和RHCE两个基因组成.这两个基因的3,端相对,相隔约有3万bp.在它们之间为小膜蛋白1基因(SMP1),即SMP1基因.在RHD基因两侧各有一段约9000bp的侧翼序列片段,称为RH盒子(Rhesusbox)序列,5端为上游R盒子(Upstream),长9142bp,3端为下游R盒子(DownstreamRhesusbox),长为9145bp,上下游盒子方向相同,与RHD基因一致.RHD和RHCE基因各由10个外显子组成,二者有43个碱基有差异,其中第1、2、8外显子序列基本一致，所以绝大多数RHD基因测定中，引物选择扩增RHD基因的3-7以及9-10外显子。通常只有D抗原阳性个体拥有一或二条RHD基因，而D阴性个体则缺失RHD基因，RHD阴性个体的RHD基因缺失发生在上下游盒子之间，并形式一个融合（HybridRhesusbox)。RHD基因locus着丝点1号染色体短臂端粒RHD阳性单倍体RHD阴性单倍体RHD基因与RHCE基因在RH座位上方向相反，但与SMP1基因方向相同（图中空心箭头）；RHD阴性单倍体RHD基因缺失发生在上下游盒子的接合区之间。5’3’3’5’3’5’3’5’下游盒子示Rh盒子序列的接合区融合盒子序列序列序列RHCESMP1RHD上游盒子RHCESMP1RHＤ和ＲＨＣＥ基因结构图1p36.11RHD等位基因的形成基因缺失：RHD基因完全缺失形成RHD(-)单倍体；基因交换：由于RHD基因和RHCE基因在RH座位上方向相反，二个同源基因之间发生交换的机率增大，通常RHCE基因为供者基因，RHD为受者基因；碱基变异：包括突变、缺失、mRNA拼接位点变异等。近几年的研究发现D基因结构存在种族差异,RhD(-)白种人中,D基因是完全缺失的.在黑人中,RHD（-）个体，D基因却完整存在，66%的D基因在第3内含子和第4外显子之间有37bp的插入片断，导致了抗原的不表达。黄种人中RhD(-)个体表现出明显的多态性.黄种人D基因的多态性D基因完全缺失(10个外显子全部缺失)导致了D抗原的不表达.D基因的部分缺失,(有两边缺失和中间缺失)导致D抗原的不表达.D基因完整存在,(碱基突变),导致D抗原不表达.RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因基因交换形成的融合等位基因RHCE(1-9)-DRHD-CE(2-9)-D1RHD-CE(2-9)-D2RHD-CE(2-7)-D1RHD-CE(2-7)-D2RHD-CE(3-7)-DRHD-CE(4-7)-D1RHD-CE(4-7)-D2RHD-CE(8-9)-DRHD基因阳性、D抗原阴性等位基因碱基变异形成的等位基因RHD(Q14X)RHD(W16X)RHDRHD(488del4)RHD(G212V)RHD(Y330X)RHD(IVS8+1GA)Del等位基因RHD(IVS3+1GA)RHD(M295I)RHD(K409K)allDELallelesareassociatedwithCeK409K又叫1227A,指第九外显子最后一个基因GA突变，也是第九外显子与第九内含子拼接位点的碱基突变，虽然４０９位置氨基酸末改变，但是剪接点突变导致产生了不正常的Ｄ抗原．弱D等位基因（５０种）弱D型碱基突变型1809TG型21154GC型38CG型4602CG,667TG,819GA型5446CA型629GA型71016GA型8919GA型9880GC型101177TC型11885GT型12830GA型13826GC型14544TA,594AT,602CG型15845GA型16658TC型17340CT型1819CT型21938CT型221224GC型23634GT型241013TC部分D等位基因D类别基因变异DI（该型别已取消）DII1061CADIIIa455AC,602CG,667TGDIIIbRHD-CE(2)-DDIIIcRHD-CE(3)-DDIIId186GT,410CT,455ACDIVa186GT,455AC,1048GCDIVb1048GC至1193ATDIVcRHD-CE(6-9)-DDIVdRHD-CE(7)-DDVa(Kou)667TG至697GCDVa(Hus)667TG至800ATDVa(TO)697GC至712GADVa(YH)667TG至744CTDVb（该型别已取消）DVc（该型别已取消）DVIaRHD-CE(4-5)-DDVIbRHD-CE(4-6)-DDVIcRHD-CE(3-6)-DDVIdRHD-CE(2-5)-DDVII329TC中国人RhD分子背景PCR技术对中国人不同D表型个体的RHD基因的检测RHD(+)*RHD(-)合计RHD(+)率(%)D阳性80080100D弱表现型16016100Del95095100相对D阴性19235154335.4真实D阴性292803099.4中国人RhD分子背景D阳性个体的RHD基因与在其它民族中报道的正常RHD基因序列相同；真实D阴性中国人中以RHD-CE(2-9)-D2等位基因为主，比率为10.5%；同时还存在比率不低的个体因碱基变异导致RHD基因ORF错位，导致正常D抗原不能表达。在真实D阴性中国人中RHD基因总阳性率为15.8%中国人RhD分子背景中国人Del个体主要携带RHD1227A等位基因(K409K)。该等位基因是Genbank收录的第一个Del等位基因(GenBank记录AF390110)，但也是中国人中唯一发现的Del等位基因，而在欧洲人中除RHD1227A等位基因外，还观察到另外几种Del等位基因弱D表型个体目前发现主要是弱D15型、还发现了2例RHD1227A等位基因携带者；部分D表型观察到DVa(Hus)和DVIIII型。中国人RHD等位基因中国人相对D阴性群体中RHD等位基因及频率等位基因在相对D阴性人群在整体人群D表型RHD-CE(2-9)-D20.0392160.002081D阴性[8]RHD270A0.0049020.000260D阴性[8]RHD710delC0.0049020.000260D阴性[8]RHDIVS6+1-4delGTAA,904-905insGGCTT0.0049020.000260D阴性[8]RHCE-D(6)-CE0.0049020.000260D阴性[8]RHD1227A0.1715690.009102Del表型[8]RHD12