细胞培养标准操作程序(SOP)

细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。3．操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.11000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。4、用1M（1mol/L）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。6、配青霉素80万/瓶+4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。3.1.2PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl8gKCl0.2g＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2O1.56gKH2PO40.2g（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）（2）Na2HPO4*H2O1.56g则Na2HPO4*12H2O需3.4888g（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可3.1.30.25%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉2.5gEDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.3gNaCl8.0gKCl0.4g`+新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000MLNaHCO30.5gGlucose(葡萄糖)1.0g酚红0.06g（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可3.2细胞复苏1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。（注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。注意：（1）入细胞室前观察CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa！（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％。（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。（4）滴管使用注意事项：a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。d．胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如2年以上），技术不过关（如吹打太激烈）、细胞传代数太多等。（6）关于PBS（平衡盐溶液）:a.PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。b.PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入2～3mlPBS（防止培养瓶干燥），培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！3.3细胞换液1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。c.生长状态不良的细胞:细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS（胎牛血清）可不温。实验开始时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边。3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS10滴加入到培养瓶中。（使FBS浓度为10％）5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培养箱中。6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。注意:（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。（2）镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。（5）培养液以没过细胞为宜。（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，容易增加污染机会。3.4细胞计数1、原理：（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。2、计数方法：(1)75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。(2)用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘（注意不要溢出，不要有气泡）。(3)观察计数：压线的记左不记右，记上不记下；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4×）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10×）进行计数。细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104(4)计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。3.5细胞传代1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。2、取灭菌试管1支，配完全培养基（含10%FBS）3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）。3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。4、胰酶消化：加入约1ml（20滴）胰酶到培养瓶里消化。胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化，（在37℃胰酶消化效果最佳）。5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次，靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。7、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略。如需进一步进行铺板则一定要计数！）8、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：5比例进行传代。先用滴管吹打混匀3ml（60滴）细胞悬液，取12滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基（培养基:FBS=9:1）使液体总体积达到4ml，平放到CO2培养箱中继续培养。9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。注意：（1）对于难消化的细胞（如Bxpc-3胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用1～2ml（即20～40滴，或1～2滴管）4℃PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤。（2）一定要防止细胞过消化！因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。*过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下来的细胞。b.培养瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过