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第三节细胞周期调控的分子机理一、MPF的生化本质、活性调节及其功能MPF（卵细胞促成熟因子，matuation-promotingfactor；细胞促分裂因子，mitosis-promotingfactor；M期促进因子，M-phase-promotingfactor）。Johnson和Rao(1970)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurelycondensedchromosome，PCC)。不同形态的PCCG1期PCC为单线状，因DNA未复制；S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制；G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：提示M期细胞存在诱导PCC的因子；1971年，Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出MPF的概念注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPFⅣⅤⅥ1979年，Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。在此后20年里，许多学者致力于MPF的提纯，试图揭示MPF的生化本质。第二个研究领域是为了弄清楚细胞周期调节基因，遗传学家们利用裂殖酵母和芽殖酵母温度敏感突变株，分离细胞增殖必需的基因（cdcgenes,celldivisioncyclegenes）1960sL.Hartwell以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，CDC)，如芽殖酵母的cdc28基因，在G1/S或G2/M转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。以P.Nurse为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞，也分离出数十种温度敏感的突变体。这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为cdc(celldivisioncycle)基因，根据被发现的先后顺序被命名。cdc2是第一个被分离出来的cdc基因，表达34kDa的蛋白，称p34cdc2。进一步研究发现其具有激酶活性，可以使许多蛋白磷酸化，在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。芽殖酵母中的一个关键cdc基因是cdc28，是第二个被分离出来的cdc基因，编码34kDa的蛋白，具有激酶活性。p34cdc28是p34cdc2的同原物，调控细胞周期，特别是G2/M期转变。但研究者很快发现，p34cdc28或p34cdc2单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合）。第三个研究领域，以美国科学家T.Hunt为代表，以海胆为研究材料，发现了细胞周期的另一个重要调控者-------细胞周期蛋白（cyclin）多年来在上述三个领域的研究，互相之间并没有联系，一直到1988年才突然打破这一局面。1988年Lohka最终将非洲爪蟾卵的MPF纯化，发现MPF由32kD和45kD两种蛋白质构成，其中32kD是Ser/Thr蛋白激酶。问题：MPF和p34cdc2有何关系？J.Maller和P.Nurse实验室立即合作，很快证明爪蟾卵中的p32与p34cdc2是同原物。与此同时，T.Hunt实验室等以海胆卵为材料研究细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关的蛋白，称为周期蛋(cyclin)。然后J.Maller和T.Hunt实验室合作，发现周期蛋白B，证明与p45和p56cdc13为同原物。这样，沿着不同路线研究细胞周期调控的科学家的研究成果汇合到一点，奇异地发现他们所研究的实际上是共同的东西，MPF即P34cdc2和cyclinB.这样一个概念逐渐明朗起来：从酵母到海洋无脊椎动物一直到人类的所有真核细胞中存在一个共同的生化分子机制来调节M期启动。因而Nurse（1990）年提出了“M期启动调节的普遍机制”这一概念。Prizecitation:fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecellcycleTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2001LelandHartwell,born1939.FredHutchinsonCancerResearchCenter,Seattle,WA,USA.PaulNurse,born1949.ImperialCancerResearchFund,Lincoln'sInnFields,London,UK.TimHunt,born1943.ImperialCancerResearchFund,ClareHallLaboratories,SouthMimms,UK.2001年的诺贝尔医学奖的获得者为一位美国科学家与两位英国科学家，他们在细胞研究领域取得了重大发现，这些发现有可能引导人们找到治疗癌症的新方法。美联社的记者对此评论说，科学家们所做的工作将使人们对癌症有了进一步的了解。二、MPF的活性调节1.蛋白质的磷酸化与去磷酸化作用①当p34cdc2与周期蛋白结合形成复合体后，wee1/mik1激酶和Cdk激酶催化P34cdc2第14位的苏氨酸(Thr14)、第15位的酪氨酸(Tyr15)和第161位的苏氨酸(Thr161)磷酸化——形成前体MPF，不表现活性；②P34cdc2在磷酸酶Cdc25c的催化下，其Thr14和Tyr15去磷酸化，才能表现出激酶活性。③Thr161位点保持磷酸化状态是CDK1激酶活性表现所必需的；2蛋白质的合成与降解P34cdc2蛋白在细胞周期中的含量相对稳定．而周期蛋白B的含量则呈现周期性变化。p34cdc2蛋白只有与周期蛋白B结合后才有可能表现出激酶活性。因而，P34cdc2激酶活性首先依赖于周期蛋白B含量的积累。细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白A和B将迅速降解，P34cdc2激酶活性丧失。周期蛋白A和B的降解是通过泛素化途径(ubiquitina-tionpathway)来实现的。MPF的活性在催化亚基P34上，其活性受调节亚基CyclinB的周期性合成与分解控制。三、MPF的功能MPF的M期可以磷酸化一系列底物，涉及染色质凝集、细胞核解体、细胞骨架崩解等很多方面。现已了解的内容包括：1.MPF能够催化组蛋白H1磷酸化。MPF可使组蛋白H1上与有丝分裂有关的特殊位点磷酸化，这些位点的磷酸化多发生在早、中期染色体凝集时期，可能与染色体凝集及有丝分裂的启动有关。2.MPF可以催化核纤层蛋白（lamin）磷酸化，导致核纤层解体。3.MPF能使necleolin(核仁蛋白)磷酸化，可能对于M期核仁分解以及染色体凝集有重要作用。4.MPF能使一些原癌基因蛋白产物发生磷酸化，由此产生一系列深远的与细胞分裂有关的生物学效应。如使c-myc基因产物磷酸化，可能降低这些蛋白在M期与DNA的结合能力，利于染色体凝集。此外，还能使P53、P105RB等蛋白磷酸化，产生一系列有关的生理效应。5.MPF作用于微管蛋白，控制着细胞周期中微管的动力学变化三、周期蛋白自1983年首次发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎动物的A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合，不同的周期蛋白框识别不同的CDK,组成不同的周期蛋白复合体，表现不同的CDK激酶活性。M期周期蛋白分子的近N端含有一段9个氨基酸组成的破坏框，参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列，可能与G1期周期蛋白的更新有关。周期蛋白分子结构特征不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。四、CDK激酶和CDK激酶抑制物在酵母cdc2和cdc28基因被分离后，几个实验室同时工作构建了人类、爪蟾和果蝇的cDNA文库，得到了一系列与cdc2相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一段类似的氨基酸序列，二是都可以同周期蛋白结合。统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶，CDK激酶。已经命名的CDK激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被发现，被命名为CDK1。各种CDK分子都含有一段类似的CDK激酶结构域，其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有关。CDK激酶的效应是多方面的，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。与cdc2类似的CDK蛋白分子图解细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CDKI）对细胞周期起负调控作用，目前发现的CDKI分为两大家族：①Ink4(Inhibitorofcdk4)，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4·cyclinD1、cdk6·cyclinD1复合物。②CIP/Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括P21cip/waf1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cip/waf1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）结合，直接抑制DNA的合成。Cyclindependentkinasesastargetsforcancertherapy周期蛋白激酶五、细胞周期转运调控周期蛋白激酶的活性（一）G2/M期转化与CDK1激酶的调控作用CDK1激酶即MPF，由p34cdc2蛋白（或p34cdc28蛋白）与周期蛋白B组成。CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。细胞中CDK激酶的活性受到多种因素的调控M-Cdk激酶的活性分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destructionbox)。当MPF活性达到最高时，通过泛素连接酶催化泛素与cyclin结合，cyclin随之被26S蛋白酶体水解。G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有降解盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。（二）M期周期蛋白与分裂中期向后期转化泛素化途径——泛素-蛋白水解酶复合物水解系统(ubiquitin-proteasomeproteolyticsystem,UPPS),该系统在细胞周期前进调控中起重要作用。泛素：是一个约76个氨基酸的高度保守蛋白；蛋白水解酶复合物是细胞质中的蛋白质复合物，由众多亚基组成，大小约26S，内含多种蛋白酶，负责降解连