荧光光谱的原理及应用

郑永丽上海交通大学化学化工学院20131115主要内容概述荧光光谱法原理荧光的光谱特性我们有关荧光的工作概述基本概念能级:现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。分子荧光光谱法(Molecularfluorescencespectroscopy)：又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行的定性分析．荧光分析法的特点灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1-3个数量级；选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；试样用量少和方法简便能提供比吸收光谱多的物理参数应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。荧光光谱法原理发射光谱的形状与激发波长无关吸收光谱与发射光谱镜像关系Stocksshift荧光和磷光的产生荧光的光谱特性荧光特性参数稳态波长和强度偏振性能量子产率瞬态荧光寿命磷光磷光寿命磷光光谱波长和强度基本概念激发波长：固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱。发射波长：固定激发光的波长而不断改变荧光的测定波长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射波长。4005006007000250000500000750000Em530nmIntensityWavelength/nmEx463nm图荧光染料C-540A的激发和发射光谱基本概念测试方法：1)判断激发波长：①根据分子结构判断；②参照吸收光谱；③三维扫描2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长强度：比尔-朗伯定律If=2.303YfI0εbc应用：定性和定量荧光波长和强度与结构的关系①跃迁类型（pi-pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强）②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强）③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活可能性小，荧光强）④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至猝灭）荧光强度与环境因素的关系•体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，称为内滤光；荧光物质浓度较大，吸收自身的荧光发射，称为荧光自吸。•具酸或碱性基团的有机物，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变•温度升高，荧光强度下降(因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低)。•①溶剂极性可增加或降低荧光强度；②与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。溶剂温度内滤光和自吸pH值有序介质的影响(表面活性剂)350400450050000010000001500000IntensityWavelength(nm)0.00010.00050.0010.0050.010.050.10.51mg/mlCMC荧光量子产率基本概念定义：荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值.(Y)测试方法：①参比法Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au)·(nu/ns)(A0.05)；②直接测量法，要求仪器有积分球注意事项：温度，溶剂，激发波长，浓度应用：量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系间跨越、外转移和内转移等的相对速率常用物质的量子产率Q.Y.StandardsQ.Y.[%]ConditionsforMeasurementExcitation[nm]Cy34PBS540Cy527PBS620CresylViolet53Methol580Fluorescein950.1MNaOH,220C496popop97Cyclohexane300Quininesulfate580.1MH2SO4,220C350Rhodamine101100Ethanol450Rhodamine6G95Water488RhodamineB31Water514Tryptophan13Water,200C280L-Tyrosine14Water270荧光偏振基本概念定义：测量：①L-型或者单通道法②T-型多通道法应用：流动性,分子基本性质,酶学分子相互作用,荧光偏振免疫,成像常用偏振研究的荧光分子：1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘磺酸钠(2,6-ANS)荧光共振能量转移(FRET)基本概念定义：当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET现象的特征:选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光FRET需要条件供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于30％；供体分子和受体分子间的距离必须在1-10nm之间.D和A间的FRET效率：R0:E=50%时供体和受体分子间的距离对于特定的供体受体对是常数;R:供体和受体分子间的距离.E:FRET效率.对于R特别灵敏供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件应用检测两个发光分子间的重合与共定位检测分子间的相互作用检测分子的折叠与构象变化供体-受体荧光分子对BFP-GFPBFP-YFPCFP-YFPCFP-dsREDGFP-dsRED绿色荧光蛋白类(GreenFluorescentProteins,GFPs)染料类(Dye)FITC-RhodamineAlexa488-Cy3Cy3-Cy5荧光寿命基本概念定义：当激发光切断后荧光强度衰减至原强度的1/e所经历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态的平均寿命。测试方法：①时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC);②相调制法(PhaseModulationMethods)③频闪技术(StrobeTechniques).应用：荧光寿命与物质所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此可以通过荧光寿命直接了解所研究体系发生的变化。荧光寿命的计算𝐼(𝑡)=α𝑖𝑒−𝑡/τ𝑖𝑖0Inthisexpressionthevaluesofα𝑖arethepre-exponentialfactorsandtheτ𝑖valuesthedecaytimes.(A1τ1+A2τ2+...)/(A1+A2+...)(A1τ1^2+A2τ2^2+...)/(A1τ1+A2τ2+...)荧光测试技术同步荧光测定；导数荧光测定；三维荧光光谱技术时间分辨荧光测定；相分辨荧光测定；荧光偏振测定；荧光免疫测定；低温荧光测定；固体表面荧光测定；近红外荧光分析法；荧光反应速率法荧光显微与成像技术；空间分辨荧光技术荧光探针技术；单分子荧光检测技术；荧光光纤化学传感器常用荧光探针探针Ex(nm)Em(nm)探针Ex(nm)Em(nm)1,8-ANS372480Cy3550570Hydroxycoumarin325386Hoechst33342343483Aminocoumarin350445EthidiumBromide493620NBD466536Fluo-3(膜穿透性)506526Fluorescein495519DPH362432RhodamineB570590EGFP488507AlexaFluro350343442Calcein496517我们有关荧光的工作荧光稳态模块磷光模块显微荧光模块系统总图荧光寿命模块图荧光分光光度计的光学系统两亲性超支化聚合物分子自组装HBPO-star-PEO荧光光谱法研究内容聚合物CMC的测定荧光猝灭法测量分子的分布能量共振转移制备荧光呼吸囊泡荧光偏振测量分子的流动性荧光寿命研究体系微环境发光聚合物荧光性能的测定聚合物CMC的测定芘不溶于水，溶于乙醇、乙醚、甲苯、四氢呋喃等有机溶剂。随着溶剂的极性增加，I1/I3降低，因而可以用于聚合物组装的研究3603804004204404604800200400IntensityWavelength/nm13JournalofPolymerScience,PartA:PolymerChemistry48(20),pp.4428-4438能量共振转移制备荧光呼吸囊泡B)SchematicrepresentationoftheprotonationanddeprotonationofPEG-b-PDMA-AzointheC)Steady-statefluorescencespectraofthevesicularsolutionatpHvaluesbetween4and12D)ReversiblepH-inducedchangeinthefluorescenceuponthealternateadditionofHClandNaOH发光聚合物荧光性能的测定参考书目JonathanD.Violin,etal.,AgeneticallyencodedfluorescentreporterrevealsoscillatoryphosphorylationbyproteinkinaseC.JCellBiology,2003,161:899–909ElizabethAJetl.,FRETImaging.NatureBiotechnology,2003,21:13887-1395RajeshBS.Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopyimagingoflivecellproteinlocalizations.JCellBiology,2003,160:629–633JinZhang,etal.,.GeneticallyencodedreportersofproteinkinaseAactivityrevealimpactofsubstratetethering.PNAS,2001,98:14997–15002MichaelG.Erickson,etal.,DsRedasaPotentialFRETPartnerwithCFPandGFP.BiophysicalJournal,2003,85:599–611AlexanderSorkin,etal.,InteractionofEGFreceptorandGrb2inlivingcellsvisualizedbyfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopy.CurrentBiology2000,10:1395–1398