DNA序列分析

DNA核酸序列分析Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert化学修饰法杂交测序Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。DNA核酸序列分析历程引物—延伸测序策略1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．RayWu）独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’,3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。将待测DNA制备成单链分子作为模板；人工合成的寡核苷酸链作为引物；引物进行放射性核素标记；退火后模板—引物结合。反应：上述混合液分为4个反应管，每个管中加入DNA聚合酶1、各一种ddNTP、以及四种dNTP（32PdATP为放射性标记）。引物延伸反应终止后加热变性分离核素标记的单链DNA分子，凝胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。（*此顺序与测序链的核酸顺序为互补。）GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACCSanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链DNA噬菌体，例如M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。克服缺点的一种途径—DNA分子克隆引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其优点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物”。M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。重组体噬菌体，在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。使用M13载体系列的优点所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。最初使用的引物，是克隆在PBR322质粒载体上的一种短的限制片段。以后J．Messing等人（1981）发展出了一种更加适用的长度为15bp的合成引物，这段引物同M13的其它位点之间有低度的同源性，后来又合成出了改进的同M13其它任何位点均无同源性的引物。现在，应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最普遍采用的快速的DNA序列分析法。Sanger双脱氧一pUC体系DNA序列分析法自引入M13载体系列，DNA序列分析又有了新的改良和发展。起初是使用Klenow片段，现在则可以使用反转录酶或T7DNA聚合酶。以往都是把待测DNA片段克隆到M13mp载体上，得到单链模板后，再按双脱氧链终止法进行序列分析。现在，可以将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法。Sanger双脱氧一pUC体系DNA序列分析法基本步骤待测DNA与pBR322或pUC分子重组；转化：转化反应物涂布在补加有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，经37℃过夜培养；挑选白色菌落，制备质粒NA。碱变性处理，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。优点：无需将DNA克隆到M13载体上，更为简单快速，现已被许多研究工作者采用。Maxam－Gilbert化学修饰法是1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和W．Gilbert发明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言，化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。Maxam－Gilbert化学修饰法的原理化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端带有放射性标记的DNA片段(双链或单链）4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割反应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA机制：G反应：硫酸二甲酯（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化A+G反应：甲酸使嘌呤环的N质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶取代。C+T反应：肼（jing，又称联氨）能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落。C反应：在一定浓度的NaCl条件下，肼只对胸嘧啶起作用。在以上修饰反应完成后，吡啶在加热条件下导致被修饰碱基处磷酸二酯键断裂。DNA样品制备待测DNA样品末端进行放射性核素标记单末端标记DNA片段的纯化碱基特异性化学降解反应序列胶高压电泳分离读取序列*所读序列即为原DNA分子碱基序列，而非互补序列。CT+CG+AAAACAGTCCTACCGCTGAAGCAG+AT+CCMaxam－Gilbert化学修饰法优点所测定的序列直接来自于原DNA分子不需要体外酶催合成反应单双链都可以需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行序列分析的自动化序列自动分析系统，即使用荧光染料标记取代同位素标记，带有荧光标记的DNA分子在激光的激发下便产生了荧光，荧光感受器马上就能感受到荧光信号，并通过信号转换，再输入到数据处理系统，直接将所测得的序列打印出来，便完成了DNA序列的测定。双脱氧末端终止法、荧光标记法、激光检测法三者结合使用安全、快速简便分析样品数量大、结果准确、重复性好