细胞生物学研究方法

翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社第3章细胞生物学研究方法第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社第一节细胞形态结构的观察方法•大多数动植物细胞20-30um,肉眼的分辨率一般只有0.2mm，很难识别单个细胞，须借助显微镜第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社光学显微镜(lightmicroscope)•从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社普通复式光学显微镜•由3部分组成：光学放大系统(目镜与物镜)、照明系统(光源和聚光镜)、镜架及调节系统第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•显微镜最重要的性能参数是分辨率，不是放大倍数•分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2um第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•普通光镜观察的生物组织样品需要固定、包埋、切片、染色等Figure9-10,11aMolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)石蜡切片H.E染色第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社相差显微镜和微分干涉显微镜•利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加两个元件，即“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”，从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别Figure9-9MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)分辨率比普通光镜提高了一个数量级应用这一原理制备的录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社荧光显微镜•荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•荧光显微镜采用的光源、激发滤片、双分镜等与普通光学显微镜不同(或没有)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•荧光显微镜样品制备技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术•样品可以是荧光染料标记，也可以用可产生荧光的绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社激光扫描共焦显微镜•在荧光显微镜上安装激光共焦成像系统，以激光为光源，提高了图像的分辨率•聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•通过调节焦平面可获得一系列不同切面上的细胞图像，重构样品三维结构第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社透射电子显微镜•透射电子显微镜利用波长比可见光短得多的、通过样品的电子束成像，放大倍数可达106Figure9-42(part2of2)MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•由于细胞厚度及细胞各部分对电子的通透差异不大，透射电镜细胞样品需要超薄切片以及重金属盐染色透射电镜制样技术第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•超薄切片技术戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社负染色技术•观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等•重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色(故名负染)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社冷冻蚀刻技术•又称冰冻断裂－蚀刻复型技术，观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感，样品不需固定包埋第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社电镜三维重构与低温电镜技术•电镜三维重构技术是对蛋白质等样品在不同的倾角下进行拍照，再经傅立叶变换等数学处理，展现出生物大分子及其复合物三维结构的电子密度图第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•低温电镜技术样品不经固定、染色和干燥，直接包被在冰膜中，在电镜内-160℃低温下利用相位衬度成像•研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社扫描电镜技术•利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌Figure9-49(MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2临界点干燥法对样品进行干燥处理•样品在观察前还要喷镀一层金膜，以获得二次电子信号第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社第二节细胞及其组分的分析方法第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社超离心技术分离细胞组分•差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社细胞成分的细胞化学显示方法•通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应定性细胞中酶时，样品制备常采用冰冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短时间固定，以尽量保持酶活性第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社细胞内特异蛋白抗原的定位与定性•细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现•若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察•为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社免疫荧光技术•它包括直接和间接免疫荧光技术两种第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社免疫电镜技术•在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫胶体金技术受到越来越多的青睐第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社细胞内特异核酸的定位与定性•原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•光镜水平的原位杂交技术(同位素标记或荧光素标记的探针)•电镜水平的原位杂交技术(生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社流式细胞术(flowcytometry)•定量细胞中DNA、RNA或特异标记蛋白的含量，或细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社第三节细胞培养与细胞工程第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社动物细胞培养•分为原代细胞和传代细胞•细胞系和细胞株•贴壁培养和悬浮培养第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社植物细胞培养•单倍体细胞培养：用花药或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，在人工培养基上进行培养最终长成植株Figure8-67aMolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•原生质体培养:体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社细胞工程•细胞融合与单克隆抗体技术第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•单克隆抗体技术：通过HAT选择培养获得分泌单抗的杂交瘤细胞株第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社显微操作技术与动物的克隆•显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•转基因(GFP)鸡、猪C.BruceA.WhitelawFEBSLetters(2004)571:233–236对照对照对照第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社第四节细胞及生物大分子的动态变化第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社荧光漂白恢复技术•高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭。由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复，而定量测定生物膜的流动性第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社放射自显影技术•利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究•2个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社•对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社第五节模式生物与功能基因组的研究•研究细胞代谢与生长、分化、衰老、凋亡等，往往需要通过各种模式生物第3章细胞生物学研究方法翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）©2011高等教育出版社大肠杆菌•原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行第3章细胞生物