39桑黄液体发酵和桑黄多糖提取纯化的研究

安徽农业大学硕士学位论文桑黄液体发酵和桑黄多糖提取纯化的研究姓名：骆冬青申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：汪维云20080601://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://://桑黄液体发酵和桑黄多糖提取纯化的研究作者：骆冬青学位授予单位：安徽农业大学相似文献(10条)1.期刊论文何培新.刘伟.HEPei-xin.LIUWei桑黄真菌的分子鉴定及分子系统学初探-湖北农业科学2009,48(4)桑黄是具有抗肿瘤等生理活性的针层孔菌属真菌,电话火木针层孔菌、鲍氏针层孔菌等多种针层孔菌属种类,具有很大的药用价值.试验硎定了一种新分离的火木针层孔菌CBL菌株的ITS序列,并与其他18份近缘材料进行了聚类分析,构建了系统进化树.初步探讨了针层孔菌属的系统发育关系.结果表明,在95%相似水平上,18份针层孔菌属材料可聚类为两大类群;火木针层孔菌CBL菌株被聚类在第Ⅱ大类群中.由系统发育树推断针层孔菌属可能是多源进化的.2.期刊论文莫顺燕.杨永春.石建功桑黄化学成分研究-中国中药杂志2003,28(4)目的:对药用真菌桑黄进行化学成分研究.方法:利用正相硅胶柱层析,Al2O3柱层析,SephadexLH-20柱层析,反相HPLC,重结晶等分离手段和IR,MS及1D,2DNMR等结构鉴定光谱方法.结果:从桑黄中分离鉴定了5个黄酮和两个香豆素类化合物,分别为柚皮素、樱花亭、二氢莰非素、7-甲氧基二氢莰非素、北美圣草素、香豆素及莨菪亭.结论:这些化合物均为首次从针层孔属真菌中发现.3.学位论文姚艳芳桑黄菌子实体发育条件的研究2007桑黄，又名鲍氏层孔菌Phellinusigniarius，(L．ex．Fr)Quel，是已知生物抗癌领域有效率最高的大型真菌，对小鼠肉瘤S,180抑制率达到96.7％，成为真菌类药物研究和开发的热点。目前市场上桑黄菌子实体供不应求，价格昂贵，野生桑黄资源匮乏，但人工栽培难度较大，文献检索显示国内外对此已有相关研究，但均处在探索性试验阶段，还没有达到推广应用的程度，关键是对桑黄菌子实体分化和发育的条件了解不够。本课题针对这一现状，通过人工培养观察及生理生化分析，总结桑黄菌菌丝生长、子实体分化发育的规律，为桑黄菌子实体商品化生产提供科学依据。实验通过聚丙烯酰胺酯酶同工酶凝胶电泳、拮抗试验和菌丝培养观察对4个常见桑黄菌株进行了种性分析。结果表明：酯酶同工酶电泳共检出22条谱带，其中迁移率不同的谱带16条，在Rf0.13～0.89之间。日本桑黄菌株、华中桑黄菌株与山东桑黄菌株和韩国桑黄菌株之间的酶谱差异明显(联合系数在0.250-0.333之间)；山东桑黄菌株和韩国桑黄菌株的酯酶同工酶谱相似(联合系数接近于1)。酯酶同工酶分析结果与拮抗试验和菌丝培养观察结果一致。菌丝培养基优化试验结果表明，桑黄一级种最适合的碳源为葡萄糖，其次是红糖，蔗糖最差。氮源用综合PDA培养基不必再另外添加。豆汁培养基有抗菌丝衰老和抗褐变的能力。桑黄菌二级种适合的碳源为棉籽壳，其次为棉籽壳与木屑掺半，纯木屑最差。桑黄菌适生于氮源丰富的固体培养基，故需要增加麸皮作为氮源，添加量为20％。实验确定了桑黄子实体最适培养条件：袋栽桑黄子实体培养应采用直接破袋出黄方法，室温28℃、散射光(1000lx)，90％以上相对湿度和良好的通气条件(日通风3次，每次15min)。实验中发现日本桑黄、山东桑黄、韩国桑黄菌能正常形成子实体，而华中桑黄不能正常形成子实体。桑黄子实体形成过程中的蛋白酶、纤维素酶、漆酶分别采用紫外分光光度法、DNS法、可见分光光度法进行测定，结果表明纤维素酶活力是桑黄菌丝长势强弱的标志，纤维素酶活力越高，菌丝长势越好；蛋白酶活力与子实体形成有密切关系，当蛋白酶活力达到峰值时产生子实体。峰值的大小由于菌种的不同而不同，日本桑黄的蛋白酶活力峰值为0.28(OD值)，韩国桑黄的蛋白酶活力为0.26(OD值)；漆酶活力在桑黄发育过程中表现的非常弱(OD值小于0.1)，说明桑黄菌对木质素的代谢能力比较弱。运用插片法、冰冻切片法分别对桑黄菌丝、子实体发育过程进行显微观察，发现桑黄菌丝具有锁状联合、双核、有横隔，桑黄子实体发育可分为四个阶段：没有菌丝分化的原基阶段、出现明显腔隙的功能分化阶段、出现生殖菌丝和附属菌丝分化的子实层形成阶段，以及生殖菌丝融合、分裂，形成四个子核，进而形成四个担孢子的孢子形成阶段。孢子成熟后通过菌管喷射至外界，孢子呈金黄色，椭圆形，表面光滑，有萌发孔，孢子的大小约为16μm×13μm。4.期刊论文齐欣.张峻.陈颖.QIXin.ZHANGJun.CHENYing珍稀真菌桑黄的研究进展-食品研究与开发2009,30(5)综述近年来国内外学者对桑黄的名称、化学成分、深层发酵、药理作用等方面的研究进展.5.期刊论文樊锦艳.王秋颖.薛梅.梁清乐桑黄胞外多糖生产培养基的初步研究-食品科技2004,(2)进行桑黄菌SA-1深层培养产胞外多糖培养基的初步研究,对桑黄菌SA-1进行了不同碳、氮源及碳、氮源含量组合的试验,测定和比较了菌丝和多糖产量.最佳碳、氮源分别为玉米淀粉、蛋白胨+酵母粉,其含量分别为4.5%、0.5%.6.期刊论文班立桐.韦东胜.王悦.BANLi-tong.WEIDong-sheng.WANGYue三种稀有真菌的营养价值及开发前景-食品研究与开发2006,27(9)介绍了虎奶菇、桦褐孔菌和桑黄三种稀有真菌的的分类及分布,营养价值和有效成分、食用价值以及开发前景,为进一步开展这三种稀有真菌的研究工作提供参考.7.期刊论文薛梅.王秋颖129木层孔菌属真菌的化学成分与生物活性-国外医药(植物药分册)2004,19(3)国内外研究成果表明,木层孔菌属的多种真菌含抗肿瘤活性成分,有待于开发抗肿瘤新药.对该属常见真菌的化学成分和生物活性进行介绍.8.学位论文王雪莲桑黄菌不同培养方法的抗癌活性研究2008桑黄是已知生物抗癌领域有效率最高的大型真菌，近年来由于过度开采，桑黄野生资源匮乏，人工培养技术尚不成熟，使其成为真菌类药物研究和开发的热点。目前关于桑黄的文献资料报道主要集中在人工培养、抗癌机理及功能成分的研究。但人工培养还处于实验室阶段，抗癌机理和有效成分的研究尚不清楚。本论文选用日本桑黄和韩国桑黄两个菌种，采用固体发酵法培养菌丝体和子实体，通过单因素和正交试验确定液体培养条件进行液体纯菌丝的培养。利用水提醇沉法提取固体菌质、子实体和菌丝中的多糖。以环磷酰胺抗肿瘤药物为对照，建立小鼠S180肿瘤移植模型，对不同培养条件下提取得桑黄多糖进行抑瘤效果的评价。利用薄层层析和岛津GC-14B气相色谱进行单糖组成分析。试验结果显示：固体菌质培养的主料分别为棉籽壳和锯末，相对于韩国桑黄，日本桑黄菌丝萌发、生长速度稍快。子实体的培养基以棉籽壳为主料，韩国桑黄子实体的分化、发育和成熟时间只需日本桑黄的1/2～2/3，分别为17～19d、19～24d和32～40d。韩国桑黄成熟子实体呈半球形，白黄色，日本桑黄呈马蹄形，黑褐色。桑黄菌的液体培养最适碳源为玉米粉，最适氮源为麸皮，最佳发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉45、麸皮25、KH2PO42、MgSO4·7H2O1。最适发酵参数为：接种量15％(V/V)、培养温度27℃、摇瓶转速160r/min、装液量160mL/500mL三角瓶、培养时间160h。在上述条件下桑黄最大菌丝生成量1.42g(干菌丝)/100mL。影响桑黄多糖提取率的主要因素是提取次数，其次分别为提取时间、提取温度和料液比。确定最佳提取工艺组合为：提取2次，95℃提取2h，料液比1:50.在此提取条件下，子实体多糖提取率分别为3.69％(H)、6.27％(R)，菌丝体(H)提取率为4.4％，固体菌质多糖平均提取率为2.87％～3.72％。100只小白鼠随机平均分成10组，分别为空白组、阴性对照组、阳性对照组和桑黄多糖组。空白组和阴性对照组给水，阳性对照组喂以环磷酰胺，多糖灌胃剂量为200mg/(Kg·bw)。实验结果表明肿瘤生长正常，药物无毒性反应。桑黄子实体(R)抗癌效果最强，高达72.64％，子实体(H)为52.36％，菌丝体为32.51％，固体菌质多糖抗癌效果不明显。多糖经DEAE-52纤维素柱层析，脱色效果明显，韩国桑黄子实体多糖略带黄色，日本桑黄子实体多糖为乳白色。本试验采用薄层层析法(TLC)对桑黄子实体多糖的单糖组成定性分析。展开剂为：乙酸乙酯：吡啶：乙酸：水=10:11:2:3，各种单糖的Rf值为：鼠李糖0.727，木糖0.576，葡萄糖0.303，阿拉伯糖0.412，果糖0.504，甘露糖0.504，半乳糖0.212。气象色谱对多糖中的单糖定量分析，结果表明：韩国桑黄(H)单糖组成为鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖，甘露糖和半乳糖，含量分别为0.258mg/mL，0.524mg/mL，9.875mg/mL，0.905mg/mL，0.659mg/mL，回收率为97.2％。日本桑黄(R)单糖组成为鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，葡萄糖，甘露糖和半乳糖，含量分别为0.102mg/mL，0.386mg/mL，0.184mg/mL，1.652mg/mL，0.282mg/mL，0.168mg/mL，回收率为95.8％。本实验结果为桑黄这一抗癌性药用菌物资源的开发利用以及抗癌机理研究提供了一定的实验依据，具有一定的科学性和应用价值。9.期刊论文莫顺燕.杨永春.石建功桑黄化学成分研究-中草药2004,35(10)火木层孔菌Phellinusigniarius(DC.exFr.)Quel又名桑黄,属于木层孔菌属(针层孔属)真菌.该真菌寄生于杨、桦、栎树等树干上,在我国东北、华北、西北及西南等地区均有分布.作为药用真菌的一种,桑黄在我国传统医药中主要用于治疗血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血不止、妇人劳损及瘰疬溃烂等症[1].有关桑黄成分的前期研究表明该真菌中含有黑色素(melanin)[2]、甾体和萜类成分,包括麦角甾醇、芳樟醇和三萜酸,以及脂肪酸类、落叶松蕈酸和芳香酸等.本实验对桑黄95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分进行了较系统的化学成分研究,从中分离得到8个化合物,并通过1D、2D、NMR、IR和MS方法鉴定了结构,分别为6-(3,4-二