荧光分析法的应用

荧光分析法的应用荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用荧光分析法测定肉类食品中诺氟沙星的残留荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用前言：亚甲蓝(Methyleneblue，简称MB)，即3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物，是一种常见的吩噻嗪类药物，其与蛋白质具有很好的亲和力，可以改变药物在生物体内的分配和代谢。其可用作癌症光化学治疗剂、起到协同抗肿瘤作用，以及肿瘤染色标记等；另外，亚甲蓝对细胞具有明显的解毒功效，在镇痛、抗菌、抗病毒等方面也有明确的治疗作用。因此研究亚甲蓝的药理作用是十分有意义的工作。色氨酸(Tryptophan，简称Trp)、酪氨酸(Tyrosine，简称Tyr)及苯丙氨酸(Phenylalanine，简称Phe)是三种芳香族氨基酸，是构成蛋白质和多肽的主要物质，是生物体中不可缺少的营养成分之一。这三种氨基酸具有荧光，也是蛋白质天然荧光的主要来源，其具有广泛的用途。开展药物与氨基酸的相互作用研究，有助于深入了解药物作用机制及在体内运输、代谢过程，而且对于新型药物的设计具有重要的指导作用。溶液配制：配制浓度为2×10-4mol/L的MB储备液；Trp、Tyr和Phe储备液的浓度分别为2×10-4mol/L、2×10-4mol/L和2×10-3mol/L(2×10-3mol/L、2×10-3mol/L和2×10-2mol/L)；配制0.02mol/L的pH7.4Tris-HCl缓冲溶液(含0.1mol/L的NaCl以恒定的溶液离子强度)。光谱测定所需溶液均使用缓冲溶液稀释、定容。荧光光谱测定：分别恒定温度在298.15K和310.15K条件下，按实验需要，准确移取一定量的MB和各氨基酸标准溶液于10mL容量瓶，用pH7.4的Tris-HCI缓冲溶液定容，水浴恒温振荡1h，然后冷却至室温，置于1cm的石英比色皿中，设置荧光光谱仪的激发和发射光栅狭缝均为5nm，光电倍增管电压为700mV，扫描速度为300nm·min-1，在此条件下记录280nm～550nm范围内的荧光光谱。结果与讨论一、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的荧光猝灭光谱分别固定Trp、Tyr和Phe浓度，依次递增MB浓度，设置Trp、Tyr和Phe激发波长为277nm、273nm和260nm，在相同实验条件下，分别测定298.15K和310.15K时MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe相互作用荧光光谱。由图可见，Trp、Tyr和Phe的最大荧光发射波长分别为346、303nm和282nm，随着MB浓度递增，Trp、Tyr和Phe荧光强度均逐渐降低，荧光光谱峰形保持不变，MB-Trp最大吸收位置红移约3nm，MB-Tyr红移约5nm，MB-Phe荧光峰蓝移约3nm。以上实验结果说明MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe发生相互作用导致Trp、Tyr和Phe发生了荧光猝灭现象。插图为荧光猝灭值(F0-F)对cMB(2×10-6～2.3×10-5mol/L)的线性拟合曲线，其中F0和F分别表示不加入和加入MB的荧光强度。相应回归方程的相关系数均在0.99以上，呈现很好的线性相关性，表明该法可用于痕量MB的测定。二、亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭机理荧光猝灭是溶液中猝灭体分子和荧光物质分子之间发生相互作用，使荧光物质的荧光量子效率降低或激发态寿命缩短，从而导致荧光强度降低的现象。荧光强度降低分为：动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是指猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间所发生的与扩散有关的相互作用过程；静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从而导致荧光强度降低的过程。MB对三种氨基酸发生的荧光猝灭，其应遵循Stem-Volmer方程：F0/F-1=Ksvc=Kqτ0c(1)式中，F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂的荧光强度；c为猝灭剂浓度，Ksv为动态Stern-Volmer猝灭常数，Kq是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数，τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命。根据式(1)绘制三种氨基酸分别在298.15K和310.15K下的(F0/F-1)～C的线性拟合曲线(如图4所示)。结果显示，MB-Trp、MB-Tyr和MB-Phe作用过程中，随着温度升高Ksv减小，说明升高温度可能降低了复合物的稳定性，从而使猝灭常数下降。由此推断MB对Trp、Tyr和Phe均为静态猝灭作用。Trp、Tyr和Phe的荧光寿命分别为3.1×10-9s、3.6×10-9s和6.8×10-9s。根据式(1)，由Ksv值计算得到Kq值及各线性回归方程相关系数R1，结果列于表1。表明，MB与上述三种氨基酸的线性拟合程度较好，且得到的Kq值均在1013数量级以上，远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散猝灭常数2×1010L·mol-1·s-1，由此推断其荧光猝灭机制是由于MB与三种芳香族氨基酸均形成基态复合物而导致的静态猝灭过程，而非由扩散过程控制的动态猝灭过程。三、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的表观结合常数Kc与结合位点数n小分子间结合的表观结合常数Kc和结合位点数n可由式(2)求出：lg[(F0-F)/F]=lgKc+nlgc(2)在298.15K和310.15K下分别作MB与三种氨基酸作用的lg[(F0-F)/F]～lgc的双对数图，如图5所示。由图5线性拟合的截距和斜率，分别获得两温度下的Kc、n和线性回归系数R2，结果见表2：得出以下结论：(1)MB与三种芳香族氨基酸的摩尔结合比n接近1：1，表明MB分子与氨基酸分子体积较为接近，一分子亚甲蓝基本是与一分子氨基酸结合；(2)相应的结合平衡常数Kc值的数量级均在105以上，表明MB与Trp、Tyr和Phe之间有较强的结合作用。四、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸相互作用力类型的确定药物和生物分子之间的相互作用力主要包括氢键、范德华力、静电作用和疏水作用等。本文在298.15K和310.15K下，基于范特霍夫方程计算相应的热力学参数，研究MB与三种芳香族氨基酸之间的相互作用力。由于△rHm随温度变化很小，故将△rHm近似为常数，由式(3)～式(5)计算MB与三种芳香族氨基酸结合的热力学参数△rHm，△rGm和△rSm，结果列于表3。由表3可看出：(I)MB-Trp反应过程中△rHm0，为吸热反应，升高温度有利于复合物的生成，所以升高温度使结合常数增大，复合物稳定性增强；(2)MB-Tyr和MB-Phe反应过程的△rHm0，反应为放热反应，升高温度将不利于向着生成复合物的方向进行，故结合常数减小，生成复合物稳定性下降；(3)MB与三种芳香族氨基酸结合的△rGm0，表明结合过程均是自发分子作用过程；(4)根据药物分子与生物大分子作用的有关热力学参数可以简单判定其相互作用类型。在MB-Trp作用过程中，△rGm0，△rHm0，△rSm0，从热力学角度看，MB主要通过疏水作用与Trp发生结合反应；在MB-Tyr和MB-Phe结合过程中，△rGm0，△rHm0，△rSm0，表明它们之间的相互作用主要是静电作用力。结论1、MB与三种芳香族氨基酸因形成基态复合物而产生静态猝灭。2、MB与各氨基酸结合摩尔比为1：1且相互之间作用力较强。3、MB与三种氨基酸之间是自发作用过程，其中MB-Trp之间主要靠疏水作用力结合，而MB-Tyr和MB-Phe结合过程以静电作用力为主。ChemicalResearchandApplication文章编号：1004-1656(2015)06-0815-07荧光分析法测定肉类食品中诺氟沙星的残留前言：诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)又名氟哌酸，为第三代喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强，毒副作用低和临床疗效高的特点，是临床应用最广泛的喹诺酮类药物之一。诺氟沙星系化学合成药物，合成容易，价格低廉，故也是动物和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，然而由于滥用现象严重，导致药物残留，给食品安全带来严重的威胁。该类药物的残留除其本身的毒副作用对人体造成直接危害外，更为严重的是人类长期食用含较低浓度药物的动物源性食品，容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而影响该类药物的临床疗效。样品前处理方法：取2g经绞碎的各种肉类食品，每次加入10mLpH=4的盐酸溶液超声提取三次，每次10min，各离心10min(3000r/min)，合并三次上清液，加入1mL的Al3+标准溶液，定容至50mL，待测。测定方法：于5mI的具塞刻度试管中配制NFLX-Al3+的最佳体系溶液，使体系溶液中Al3+浓度为2.0mmol·L-1、pH=4.0，静置5min，取试液置于1cm×1cm石英液池中，设置激发和发射单色仪狭缝宽度均为5nm，扫描速度为1200nm·min-1，利用荧光分析法测定。结果与讨论一、金属离子的选择许多金属离子可与诺氟沙星发生络合反应，使荧光强度发生变化。实验考察了Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+和Ni2+等七种不同金属离子与诺氟沙星配位反应后荧光强度的变化，结果发现Al3+、Fe2+、Mg2+和Zn2+与诺氟沙星配位后荧光强度增强，增强的顺序为Al3+Zn2+Fe2+Mg2+；而Fe3+、Cu2+和Ni2+使诺氟沙星的荧光强度受到猝灭。因此，我们选择Al3+增强诺氟沙星的荧光强度作为分析测定的条件，其荧光光谱变化如图1。二、稳定性实验实验考察了NFLX-Al3+反应体系在24h内荧光强度的变化情况。结果可得从0～5min之内，体系的荧光强度呈递增状态，从5min到24h之间，荧光强度的变化在3%以内，因此实验选择NFLX-Al3+体系反应5min后进行分析测定。三、pH值的影响诺氟沙星结构中的氧原子和氮原子在不同酸碱溶液中的质子化程度不同，从而影响发光体系的电子性质以及电子云分布，最后使NFLX-Al3+体系的荧光性质和强度发生变化。实验考察了在不同pH值溶液中荧光强度的变化，结果如图2所示，当溶液的pH=4时，NFLX-AI3+体系的荧光强度最大。四、Al3+浓度的影响实验选择诺氟沙星与不同Al3+浓度进行反应，测量其荧光强度的变化，结果可得当Al3+浓度达到2.0mmol·L-1时体系的荧光强度最大且处于稳定，见图3。故实验选择Al3+浓度为2.0mmol·L-1作为反应的浓度。五、样品背景干扰情况肉类样品的基体复杂，实验考察了各种肉类样品基体的干扰情况，从实验结果可得空白肉类基体主要是内源性蛋白质的干扰，即内源性蛋白质有着较强的荧光强度，但在本实验选取的最佳条件下荧光峰位置λem=433nm处测定时，内源性蛋白质的荧光强度可以忽略不计，见图4。六、标准工作曲线和检出限梯度配制不同浓度的诺氟沙星标准溶液，在最佳实验条件下，荧光法分别测定每一种溶液的荧光强度，以λem=433nm处的荧光强度对诺氟沙星的浓度作工作曲线，见图5。得诺氟沙星的线性方程为F=15.89+36.50C，线性范围为0.5～250ng·mL-1，相关系数R=0.9999，方法的检出限为0.032ng·mL-1。七、精密度实验配制6份相同质量浓度为10ng·mL-1的诺氟沙星溶液，在一定的实验条件下进行荧光法测定，得诺氟沙星的相对标准偏差(RSD)为2.3%。从实验所得结果来看，该方法具有很好的精密度。八、加标回收率实验分别在不含有诺氟沙星的各种肉类食品中加入不同量的诺氟沙星，设定最佳实验条件进行测定，每一份样品平行测定三次，结果取平均值，实验所得数据见表1所示。结论实验采用Al3+与诺氟沙星配位增强荧光强度，建立了肉类中诺氟沙星药物残留的直接荧光分析法。样品只需通过简单的处理，不需要分离，即可用于复杂肉类基体中诺氟沙星药物残留的痕量测定，且实验结果具有很好的准确度、灵敏度和选择性。谢谢！