荧光和化学发光的基本知识

荧光和化学发光的基本知识按光谱分类：狭义：可见光（400-700nm）广义：紫外光（10-400nm）可见光（400-700nm）红外光（700-40000nm）光的基本知识1.炽热光或白炽光(incandescence)-因热而发光2.气体激发(gasexcitation-因电子或热的激发而发光3.摩擦发光(triboluminescence)4.电激發光(electroluminescence)5.荧光(fluorescence)-因光激发而发光，但光源切断后即不再发光6.磷光(phosphorescence)-因光激发而发光，但光源切断后仍会持续发光7.化学发光(chemiluminescence-非生物体把多余的化学能转变为光能8.生物发光(bioluminescence)-生物体利用化学能发光发光物质荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。什么是荧光？一、荧光发生过程荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。荧光发生是一个3阶段的过程。①激发外源的白炽灯或激光提供的能量（hvEX）的光子被荧光体吸收，产生被激发的电子单峰态（S1’）。这个过程是荧光和化学发光的区别，化学发光的激发态是由化学反应产生的。②激发态的寿命期激发态存在一个有限的时间（通常是1-10x10-9秒）。在这时间，荧光体经历构象的改变和容易受到分子环境的相互作用的影响。这些过程有两个重要的结果。第一，S1’的能量部分被消耗，形成一个衰减的单峰激发态（S1）即荧光发射的初始。第二，不是最初被激发的所有分子都通过荧光发射回到基态。其他的过程，象振动淬灭，荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量子的产生量，取决于激发的荧光光子数量与吸收的光子数量的比率，是衡量荧光效率的参数。③荧光发射能量（hvEM）光子被激发，荧光体回到基态S0。由于能量在激发态寿命期的部分消耗，这些光子的能量较低，因此比激发光子hvEX有更长的波长。这种由于（hvEM-hvEX）呈现的能量或波长的差异称作Stokes漂移。Stokes漂移奠定了荧光技术灵敏性的基础，因为它可以与激发光子在光谱上分离，而在一个较低的背景下检测发射光子。相比较而言，吸收光分光测定法在透射光检测时相对于较高水平的同一波长的光。EmissionFExcitation荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发光EmissionExcitationF2F1Transfer荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：传递ExcitationBHFTransfer荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发热二、荧光发射光谱和激发光谱¾发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。¾激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光光谱荧光寿命¾定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。¾各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。三、荧光的性质•吸收光•保持固有的荧光特性•荧光波长＞激发波长（STOKES法则）•荧光强度极小于激发光的强度•有不同程度的衰减•荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率四、荧光的产生与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（ϕ）：吸收的光量子数发射的光量子数=ϕ荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关。2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：π*→π的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。五、影响荧光强度的因素影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的猝灭碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。常用的荧光物质六、荧光物质七、荧光检测荧光检测仪器荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出，通常是电子信号或图像。3种主要的荧光检测仪器提供不同的数据。•荧光分光光度计：测定液体样品（uL-mL）•荧光显微镜：解析荧光作为二维或三维空间位置定位功能•流式细胞仪：测定流体中每个细胞的荧光，在大量样品中进行分选并识别和定量•激光扫描仪荧光信号荧光强度的定量取决于这些参数：吸光度，光径和稀释浓度，染料的荧光量子的产量，激发光源强度和仪器荧光采集效率。在稀释溶液或悬液中，荧光强度与这些参数成线性比例关系。某些荧光物质（例如Luminol,C8H7N3O2）可將化学反应中产生的能量，转化成使分子內的电子由基态（groundstate）跃升到激发态（excitedstate），处于激发态的分子并不穩定，將能量以光的形式释放出來；有的光波长为可见光范围，但占多数的是荧光（fluorescence）。化学发光化学发光的原理1.X光片压片（传统方法）但曝光时间需要摸索，压片法有一定不便，定量也不准2.扫描仪一定波长范围扫描3.成像仪CooledCCD4.荧光化学发光酶标仪化学发光检测方法杂交检测中的信号物质（非放射性标记）：1.核酸杂交（Southern&NorthernBlot）2.蛋白印迹（WesternBlot）3.酶联免疫（Elisa）4.其他：dot/slot杂交、原位杂交、噬菌体文库筛选、菌落文库（质粒文库）筛选…化学发光在生物学检测中的应用Luminol（～430nm）CSPD发光最强最持久：CDP-Star（～460nm，蓝光）Sapphire-II™发光增强剂Emerald-II™发光增强剂注：一般的试剂盒中已将发光底物与发光增强剂预先混合为发光底物Luminol几种常用的发光底物及增强剂