13基因工程复习提纲-微软雅黑v1.13

1基因工程复习提纲1.什么是基因？基因：是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。种类：编码蛋白的基因、只转录而无翻译功能的基因（tRNA，rRNA）、不转录的基因。2.基因工程的诞生基因工程诞生于1973年。1973－1974年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料，成功地进行了三次基因工程试验。试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。人类进入了激动人心的基因工程时代。第一个实现DNA重组的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。第一个取得基因工程成功的人－Cohen1973年，CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒进行体外限制酶切割，并连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了tetrNer的转化子,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。GohenGroup第一次实现了细菌遗传性状转移示意图21、理论上的三大发现（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA。（2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。2、技术上的三大发明（1）限制性核酸内切酶（restrictionenzymes）的发现20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。（2）DNA连接酶（ligase）的发现（3）基因工程载体（vector）的发现有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。1946年起，Lederberg开展了细菌性因子（F因子）的研究。50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。直到1973年,Cohen开始将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。3.基因工程的定义及三大基本元件。定义：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。（基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达）（重组DNA技术——又称为分子克隆技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。）供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。34.基因工程的研究内容(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段；(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子；(3)将重组DNA分子引入（转）到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)；(4)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆；(5)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。5.基因工程的技术准备及技术支撑。①核酸凝胶电泳技术；②核酸分子连接技术；③细菌转化技术；④DNA序列分析技术；⑤寡核苷酸合成技术；⑥基因定点突变技术；⑦聚合酶链式反应（PCR）技术。6.基因工程的基本用途a．分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；b.大规模生产生物活性物质；c.设计、构建生物的新性状甚至新物种7.核酸酶的分类核酸酶——能够将核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。根据核酸底物分——RNA酶（Rnase）；DNA酶（Dnase）；底物非专一性核酸酶根据作用方式分——内切核酸酶；外切核酸酶根据对底物碱基专一性分——碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）；非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）8.细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。4限制-修饰系统a.限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。b.修饰作用：生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。c.限制-修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。细菌中的防卫系统：限制与修饰现象（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来DNA的入侵。（3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。（4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存。（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解。5图核酸内切限制酶EcoRⅠ及其修饰的甲基化酶MEcoRⅠ的限制与修饰作用EcoRⅠ识别序列经MEcoRⅠ甲基化后，就再不能使EcoRⅠ所切割9.作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5α）的必须条件分子克隆宿主菌（E.coliDH5α），必须是——（1）rec基因缺陷型的菌株：保证不与外来DNA分子发生遗传重组。（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株：保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。10.限制性核酸内切酶1)最重要的是哪一类？Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。2)命名：属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株HindⅢHindⅡ——同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶H：细菌属名的头一个字母in：细菌种名的头两个字母Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体6d：代表该菌菌株名称III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶3)II型限制性内切酶的基本特征：a.识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列b.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧c.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构d.切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端e.错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端↓EcoRⅠ的切割位点EcoRⅠ的识别序列5’…GCTG↓AATTCGAG…3’3’…CGACTTAA↑GCTC…5’4)回文结构：a.序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。b.在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。5)限制性内切酶形成的末端结构：（具体粘性末端的写法在第二章ppt18页）粘末端(stickyend)：两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段。包含5’粘性末端和3’粘性末端两种类型。平末端(blantend)：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。6)（位点偏爱（sitepreference）——某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别7序列表现出不同的切割效率。（不同位点形成不同的二级结构，限制酶的活性。）星号活性（staractivity）——又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。7)同裂酶——有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，切割位点可以相同，也可以不同。图同裂酶示例8)同尾酶——来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。例如：8BamHⅠ和BglⅡ是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由“-GATC-”4个核苷酸组成的粘性末端。9)限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。（因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。）10)因为识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性，所以在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌。11.DNA聚合酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）的用途：缺口平移大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质——①5’→3’的DNA聚合酶活性；②5’→3’的核酸外切酶活性；③3’→5’的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途——a.缺口平移（Nicktranslation）：5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进；b.制备32P标记的DNA探针9图DNApolI缺口平移（2）大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）的性质及用途：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端Klenow酶的来源：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获得其N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶的基本性质——拥有5’→3’的DNA聚合酶活性拥有3’→5’的核酸外切酶活性丢失5’→3’的核酸外切酶活性Klenow酶的基本用途——①补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端——10②DNA片段的同位素末端标记——③cDNA第二链的合成；④双脱氧末端终止法测定DNA序列（3）T4-DNA聚合酶：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端T4-DNA聚合酶的基本特性5’→3’的DNA聚合酶活性3’→5’的核酸外切酶活性不具有5‘→3’核酸外切酶活性在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位T4-DNA聚合酶的基本用途I——切平由核算内切酶产生的3’粘性末端11T4-DNA聚合酶的基本用途II——DNA片段的同位素末端标记（4）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性I：以RNA为模板合成cDNA链反转录酶的基本特性II：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶的基本用途将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库对具有5’突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针代替Klenow片段，用于DNA序列测定12.DNA连接酶能够催化2条DNA链间形成磷酸二酯键的酶。需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基(-OH)，另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团12(-P)。只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的作用。（注意：DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分）常用的两种DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶、T4噬菌体T4DNA连接酶DNA连接酶的基本性质（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键（3）连接平头双链DNA分子粘性末端的连接——DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生13连接作用，形成重组DNA分子。