第八章 印迹杂交技术

第八章印迹杂交技术Molecularhybridization——指将样品（核酸或蛋白质）分离并转移到固相载体上，然后在载体上利用特异性的反应来检测样品的一种方法。印迹技术(blotting)•印迹法分类：SouthernBlotingDNA杂交NorthernBlotingRNA-DNA杂交WesternBloting蛋白质印迹核酸分子杂交的基本原理核酸变性：在某些理化因素作用下，核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。温度、酸碱、有机溶剂、尿素等DNA变性：在变性因素作用下，DNA分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构解开成两条单链的过程。DNA复性（renaturation）：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。退火（annealing）：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱•增色效应：核酸在变性过程中260nm波长吸收值（A260）增加•减色效应：核酸在复性过程中260nm波长吸收值（A260）减小DNA加热50%DNA发生变性此时的温度——解链温度（meltingtemperature,Tm）G—C百分含量与Tm的关系核酸分子杂交不同来源的核酸经过变性和复性，其中一些局部碱基互补片段在复性时形成杂化双链的过程。（固相和液相杂交）探针(probe)——能与待测的分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子（带有标记物）。•探针的检测对象：核酸、蛋白质、细胞结构等。•除核酸探针外，探针利用抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用的原理与靶分子结合。核酸探针——带有标记物且序列已知的核酸片段，能与待测核酸中的特定序列特异杂交。•核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析能否成功的关键。核酸探针应具有的条件①特异性高：只与待测核酸样品中的互补序列杂交。②为单链核酸：用双链核酸制备的探针使用前要先变性解链。③带有标记物：标记物灵敏度高而稳定，检测方便。核酸探针的种类基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针基因组DNA探针最常使用；用克隆化的各种基因片段制备注意：尽可能用基因的编码顺序（外显子）作为探针优点：制备简便；不易降解；标记方法成熟。cDNA探针优点：mRNA逆转录而来，不含内含子等非编码区，特异性高；适用于研究基因表达。缺点：获取过程复杂，不易制备RNA探针①RNA探针是单链探针，所以不会自身退火，与待测核酸的杂交效率较高，杂交体的稳定性更好②RNA探针大小一致，使杂交的敏感性和均一性更强③RNA中不含高度重复序列，所以非特异性杂交也较少④杂交之后可以用RNase将未杂交的游离RNA探针降解，从而降低本底⑤缺点：探针易降解、标记方法复杂。寡核苷酸探针①根据已经核酸序列人工合成的DNA探针；②复杂性低，因而杂交所需的时间较短；③是单链探针，所以不会自身退火；④长度一般为17～30nt，只要其中有一个碱基不配对就会影响杂交，因而特别适合于分析点突变⑤缺点：不如长的杂交核酸分子稳定。所带标记物较少，特别是非放射性标记时，灵敏度较低。因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，以采用较长的探针为好。核酸探针标记物分类：放射性标记探针非放射性标记探针1、放射性同位素——应用广泛，以32P应用最普遍，放射自显影。优点：灵敏度高；缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14.3天）：位和位标记。35S：分辨率高、半衰期长（87.1天）敏感度低2、非放射性标记物•生物素（biotin）：一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上与抗生物素蛋白（亲和素或链霉亲和素）特异结合抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等)。优点：无环境污染，可长时间贮存。地高辛（digosigenin）：一种类固醇半抗原分子可利用其抗体进行免疫检测原理类似于生物素的检测。•常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随机引物法、PCR标记法、末端标记法等方法标记探针。核酸探针的制备切口平移法反应成分：DnaseI、EcolipolI，dATP、dGTP、dTTP、32P-dCTP，待标记的DNA片段标记结果：两条链都均匀标记。切口平移法•限量DNaseI在待标记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连缺口；•利用E.coliDNA聚合酶I的5’-3’外切酶的活性和5’-3’聚合酶的活性，在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口。•随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连中。•随机寡核苷酸引物（randomprimer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段（6-10nt）的混合物，可以与任意核酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用。随机引物法（randompriming)•E.coliDNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5’-3’聚合酶的活性，而无外切酶的活性）随机引物法（randompriming)反应成分：随机聚核苷酸引物，待标记DNA模板，Klenow片段，dNTP中一种带放射性标记。PCR标记法•在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。末端标记法•DNA末端标记法只是将DNA片段的一端（5’端或3’端）进行部分标记。•缺点：标记活性不高，标记物掺入率低，一般极少用做核酸分子杂交探针标记。核酸印迹杂交技术流程DNA印迹杂交的主要步骤•待测DNA样品的制备、酶切•待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳•凝胶中DNA的变性：碱变性•印迹（转膜）：–硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜–毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法•预杂交（封闭）•探针的制备•固相膜上杂交（控制温度）•洗膜：除去游离的探针•杂交信号的检测固相支持物与有效的转移方法是此技术的成败关键。常用固相支持物1）硝酸纤维素膜（nitrocellulosefiltermembrane）•具有较强吸附单链DNA和RNA的能力（高盐下达80µg/cm2～100µg/cm2）。•真空烘干后，依靠疏水性相互作用。•杂交本底较低、操作简便。－－不易反复杂交和洗膜（结合力）－－质地较脆，烘烤后更甚，小心操作－－与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，不易核酸电转2）尼龙膜（nylonmembrane）•结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达350µg/cm2～500µg/cm2）。•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。•韧性较强，操作方便。•能结合小分子核酸。•低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。•可反复杂交和洗膜。－－杂交本底较高——是指将核酸,蛋白质等生物大分子固定在印迹膜上的过程。将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上，转移后各待测核酸片段在固相膜上的相对位置和在凝胶中的位置一样。转膜（印迹，blotting）•（1）物理吸印方法（毛细虹吸真空抽吸）•（2）电转印方法上行毛细管转移凝胶滤纸玻璃板重物（500g）转移缓冲液滤纸NC膜或尼龙膜吸水纸1）毛细管虹吸转移法向下的毛细管转移法2）真空转移法使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷3）电转移法①一般用尼龙膜作电转移的载体（NC膜不行）②单链DNA和RNA可进行转移，双链DNA先在原位进行碱变性，随后中和，再转移③特点：转移快，2-3小时即可；常用核酸杂交分类Southern印迹检测经凝胶电泳分开的DNA分子,需转印到膜上Northern印迹检测经凝胶电泳分开的RNA分子,需转移到膜上斑点杂交检测未经分离的,固定在膜上的DNA或RNA分子菌落杂交和噬斑杂交检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和噬菌体中释放的DNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子杂交方法适用范围DNA印迹法（Southernblot）将电泳分离的待测DNA片段转移并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。用途：检测DNA（目的DNA的存在、DNA的分子量、基因突变等）放射自显影照片操作：与Southern印迹极为相似，但不需要酶切可直接变性转移；RNA经变性后再电泳；凝胶中加甲醛保持RNA单链。用途：检测RNA（基因mRNA表达水平）RNA印迹法（Northernblot）（三）斑点杂交和狭缝杂交法操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品变性后点在干的NC上，与探针杂交。用途：检测DNA样品同源性、细胞内特定基因拷贝数；mRNA的相对含量。（四）菌落杂交法和噬菌斑杂交法操作：NC膜拓印培养的菌落→原位裂解菌落、释放DNA→预杂交、杂交、杂交结果分析→从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落。用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落或噬菌斑菌落杂交概念：用特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu)用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位；研究细胞特定基因表达水平；确定组织有无病原体感染等。（五）核酸原位杂交（组织原位杂交）（六）等位基因特异性寡核苷酸杂交法（ASOH）根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：纯合子杂合子正常病变基因探针（M）正常基因探针（N）基因缺陷ASOH检测苯丙酮酸尿症蛋白质印迹法（Westernblotting）用途：鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。蛋白质印迹法的基本步骤1、电泳分离——SDS－PAGE分离2、印迹——电转移法（最常用）转至固相膜（NC最常用）3、封闭——封闭固相膜上所有蛋白质吸附点4、检测分析——用抗原－抗体反应检测印迹在固相膜上的目的蛋白（常用的标记酶有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）几种蛋白转印膜的特点比较蛋白质印迹法注意事项1、选用合适的SDS－聚丙烯酰胺凝胶浓度分离效果好。2、选用小孔径的固相膜，避免小分子蛋白丢失。3、检测信号强弱受多种因素影响，一般只作半定量指标。三种印迹技术的比较双向电泳蛋白质印迹技术（Easternblotting）+-+-