转录组学研究技术及其应用

转录组学研究技术及其应用目录：•一、转录组简介•二、主要技术及其原理•三、与蛋白质组研究进展比较•四、转录组学应用•五、参考文献一、转录组简介•1、概念•2、转录组学•3、相关知识1、概念遗传学中心法则表明,遗传信息在精密的调控下通过信使RNA(mRNA)从DNA传递到蛋白质。因此,mRNA被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的一个“桥梁”,而所有表达基因的身份以及其转录水平,综合起来被称作转录组(Transcriptome)。转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和,主要包括mRNA和非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)。2、转录组学研究生物细胞中转录组的发生和变化规律的科学就称为转录组(transcriptomics)。转录组学（transcriptomics），是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。3、相关知识（1）四大组学基因组转录组蛋白质组代谢组解释人类生老病死奥秘的四大组学（2）基因组学基因组学（英文genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。•1基因组发展趋势图（3）蛋白质组学蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是在1995年提出的。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径（4）代谢组学代谢组学(metabonomics／metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。代谢组学研究进展二、主要技术及其原理1、基因芯片技术(Microarray)2、基因表达系列分析技术(Serialanalysisofgeneexpression，SAGE)3、大规模平行测序技术(Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)4、RNA测序技术(RNAsequencing，RNA-seq)。1、基因芯片技术(Microarray)在转录组研究中应用最早及最广泛的为基因芯片技术(Microarray)，首先从待检测样品中提取RNA，并利用荧光标记的核苷酸将其反转录成cDNA，经过标记的核苷酸序列可与基因芯片特定位点上的探针杂交，经检测杂交信号而获取细胞基因表达信息。基因芯片原理图2、基因表达系列分析技术(SAGE)基因表达系列分析技术技术是一种基于测序技术、开放式的、快速高效的分析细胞基因表达状态的方法，该技术不需任何基因序列的信息，能够全局性地检测所有基因的表达水平。3、大规模平行测序技术(MPSS)MPSS技术是对SAGE技术的改进，但其原理都是基于短标签测序(Tag-basedsequencing)的方法。MPSS技术可获得更长的短标签，因而精度更高；此外，MPSS技术特有的微球荧光测序可直接高通量读出序列，简化了测序过程。4、RNA测序技术(RNAsequencing，RNA-seq)RNA测序技术(RNA-seq)新一代高通量基因组测序仪的迅速发展(Solexa，454GS-FLX，SOLiD，tSMS)不仅给基组领域带来革命性的突破，同时也给转录组检测方法带来重大革新。采用类似SAGE技术和MPSS技术的理念，新一代高通量基因组测序仪可以通过测定细胞全部转录产物序列，通过序列比对得到最后的转录组，一个新的测定转录组的“RNA测序”法出现了，该技术称为RNA测序技术(RNA-seq)。RNA-seq技术可以提供更多信息，可以得到用基因芯片难以得到的转录可变剪接序列；该技术对低表达基因的检测更加准确，并且可以定量确定转录水平。RNA-Seq原理把上述高通量测序技术应用到由mRNA逆转录生成的cDNA上,从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量,这就是mRNA测序或mRNA-Seq,同样原理,各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量检测,统称作RNA-Seq。该技术[3]首先将细胞中的所有转录产物反转录为cDNA文库(利用最新的SMS技术可略去这一步,直接对RNA进行测序[19]),然后将cDNA文库中的DNA随机剪切为小片段(或先将RNA片段化后再反转录),在cDNA两端加上接头利用新一代高通量测序仪测序,直到获得足够的序列,所得序列通过比对(有参考基因组)或从头组装(denovoassembling)(无参考基因组)形成全基因组范围的转录1RNA-Seq实验流程图RNA-Seq技术优势1(1)数字化信号；直接测定每个转录本片段序列,单核苷酸分辨率的精确度,可以检测单个碱基差异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同转录本的表达,同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题,能覆盖信号超高的动态变化范围。(2)高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。(3)任意物种的全基因组分析；无需预先设计特异性探针,因此无需了解物种基因信息,能够直接对任何物种进行转录组分析,这对非模式生物的研究尤为重要,例如Wang等、Xiang等和Vera等利用RNA-Seq技术分别对白粉虱、海鲈鱼和蝴蝶转录组进行了研究。同时能够检测未知基因,发现新的转录本,并精确地识别可变剪切位点及cSNP,UTR区域。(4)更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围,能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本;而芯片对过低或过高表达的基因缺乏敏感性,因而动态检测范围小。此外,RNA-Seq重复性好,无需技术重复,而且起始样品比芯片技术要少得多,尤其适用于来源极为有限的生物样品分析,如癌症干细胞。三、与蛋白质组研究进展比较转录组与蛋白质组比较研究发现，总体而言其间的相关性不高。根据数据的类型不同可以将现有的研究分为4类：单点比较、两点差异比较、多点时序比较和多点非时序比较。对其差异原因的研究和分析表明：除了由实验系统及数据类型不同导致的差异外，转录蛋白质合成各步骤受到的限制，以及在此过程中的分子调控也对其有重要的影响；而且不同基因，不同组织和细胞在不同状态下可能也会有差异。因此，结合转录组和蛋白质组的表达谱研究倾向于利用蛋白质组和转录组研究的差异和互补性，同时对生物体特定状态下的基因和蛋白质表达水平进行全方位度量，以获得表达谱的全景图，并挖掘受到转录后调控的基因。四、转录组学应用1、转录组在代谢工程领域的应用2、转录组学在药用植物研究中的应用3、转录组学在植物细胞特性的改造方面的应用1、转录组在代谢工程领域的应用动物细胞系目前已经被广泛用于蛋白质药物等产品的大量生产上，利用动物细胞表达蛋白其优势在于有助于蛋白质正确折叠、组装并进行翻译后的修饰，目标蛋白质可正常行使其功能。转录组分析在减少细胞代谢负担、控制细胞贴壁性、调控细胞生长活性等方面都有成功的应用12、转录组学在药用植物研究中的应用目前，1/3以上的临床用药来源于植物提取物或其衍生物。随着分子生物学向各个学科领域的渗透及蛋白质组学和生物信息学的应用，阐明药用植物天然活性成分生物合成途径及其关键酶，实现关键酶基因的克隆与体外高效表达，利用现代生物技术手段及次生代谢工程，大规模生产药用植物的有效成分将成为未来发展方向之一。通过对物种的转录组进行描述，能够对理解物种的生物学和生物化学的各个方面提供新的信息。虽然药用植物有效成分的化学和药理学研究已经具有良好的基础，但是在天然活性成分生物合成途径和调控方面研究还很薄弱。目前，该领域的研究主要集中在长春花、青蒿、红豆杉和甘草等少数物种，这些研究多采用单基因研究策略。例如ColluG.等将候选细胞色素P450基因转化长春花的悬浮细胞，验证了其具有10-香叶醇羟化酶的催化功能；SekiH.等利用昆虫外源体内共表达和酵母体外表达检验酶活的方法鉴定了甘草中的三萜甘草酸合成关键酶基因；WildungMR&CroteauR.A采用同源探针筛选太平洋参紫杉cDNA文库并结合GC-MS的方法，鉴定了紫杉醇生物合成中的关键酶TaxadieneSynthase基因3、转录组学在植物细胞特性的改造方面的应用植物的生长发育及产量与外界环境密切相关，通过代谢工程手段可以显著提高植物对环境胁迫的抗性，保护植物免受外界环境的不良影响。Seki等对拟南芥转录组分析，得到了44个受干旱诱导基因以及19个受冷诱导的基因，其中有12个基因被确定为植物胁迫应答的重要调节因子CBF/DREB(C-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-element-binding)的靶基因。这些靶基因的确认对深入认识植物产生环境胁迫抗性的机理具有重要意义。Benedict等将拟南芥的冷胁迫应答转录因子CBF1转入杨树，使其冷耐受性明显增强，同时发现杨树中受拟南芥CBF1调控的基因与拟南芥中相应基因具有高度一致性。该研究指出CBF/DREB1冷调控机制可增强植株对多种逆境的抵抗性五、参考文献【1】转录组研究新技术：RNA-Seq及其应用祁云霞,刘永斌,荣威恒遗传HEREDITAS(Beijing)2011年11月,33(11):1191―1202ISSN0253-9772【2】转录组与蛋白质组的比较研究进展吴松峰、朱云平、贺福初生物化学与生物物理进展2005；32（2）【3】转录组平台技术及其在代谢工程中的应用史硕博、陈涛、赵学明生物工程学报ChinJBiotech2010,September25;26(9):1187−1198journals.im.ac.cnChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061【4】转录组学平台技术及其在植物抗逆分子生物学中的应用付畅、黄宇生物技术通报2012年第六期【5】AnewRNASeq-basedreferencetranscriptomeforsugarbeetanditsapplicationintranscriptome-scaleanalysisofvernalizationandgibberellinresponsesMutasa-Gotgensetal.BMCGenomics2012【6】转录组学在药用植物研究中的应用吴琼、孙超、陈士林、罗红梅、李滢、孙永珍、牛云云世界科学技术—中医药现代化-专题讨论：中药资源研究的前沿技术2010第十二卷第三期