抗原抗体检测技术

抗原抗体检测技术抗原与相应的抗体在体外相遇时可发生特异性结合，呈现某种反应现象。根据抗原的物理性状及参与反应的物质不同可以分为凝集反应、沉淀反应及补体参与的各种反应等。一、直接凝集在玻片或其它支持物上，颗粒性抗原（细胞、细菌等）与相应抗体在有适量电解质存在时，直接结合可形成肉眼可见的凝集块。该方法简便，快速，为定性试验，常用于鉴定抗原。（一）玻片凝集-ABO血型鉴定根据人红细胞表面ABO血型抗原和人血清中ABO抗体，可将人血型分为A型、B型、O型和AB型。A型：有A抗原，抗B抗体；B型：有B抗原，抗A抗体；AB型：有A和B抗原，无抗A抗B抗体；O型：无A和B抗原，有抗A和抗B抗体。检测红细胞表面ABO血型抗原，标本为红细胞，称为正定型。检测人血清中抗A、B抗体，标本为血清，称为反定型。1、正定型⑴材料：①红细胞标本：采静脉血。②抗体试剂：抗A、抗B血型抗原单克隆抗体（血凝效价256，亲合性少于15秒）。③生理盐水。④器材：玻片、小试管、小巴氏管、小吸球、无菌注射器、止血带、牙签、记号笔、酒精棉球、碘酒棉球等。⑵方法：①取一块玻片或瓷砖片，按下表标记划格，每块板可以检测5人。红细胞标本试剂12345抗A抗体抗B抗体抗原型别②取试管，装入1ml生理盐水。皮肤消毒后，静脉抽血1ml，滴2滴入试管中（余下静置，留取血清，做反定型用），混匀。③取盐水稀释后的血液滴在玻片的相应上下格中，各1滴。④滴抗A、抗B单克隆抗体试剂各一滴于相应的上下格中，立即用牙签搅匀红细胞及抗体。搅抗A和抗B格时要用牙签的不同端。5⑤秒钟内就可形成凝集物。要在3分钟内观察结果并记录。出现凝集的记＋，无凝集的记－，出现凝集的即为该标本所有的ABO血型抗原。2、反定型⑴材料：①红细胞试剂：ABO同型血2～3人份混合，生理盐水洗涤3遍后，制备成2%红细胞生理盐水悬液。②被检血清标本：见正定型方法2。③用正定型材料（3）和（4）。⑵方法：①玻片或瓷砖片，按下表标记划格。血清标本红细胞12345A型B型抗体型别②取血清标本分别滴入上下相应2个格中，各1滴。③分别滴A和B型红细胞于相应格中。④立即用牙签搅匀血清和红细胞。用牙签的不同端搅匀A和B红细胞。3⑤分钟内观察结果，出现凝集的记为＋，无凝集的记为－，出现凝集者即为血清中含有的ABO抗体。3、试验结果判定：红细胞标本1234抗A＋－－＋抗B－＋－＋血清标本A细胞－＋＋－B细胞＋－＋－血型ABOAB（二）试管凝集原理：在试管中，颗粒性抗原（细胞、细菌等）与相应抗体在有适量电解质存在时，直接结合可形成肉眼可见的凝集块。应用：⑴用已知的病原菌为抗原，与病人血清作定量细菌凝集试验，辅助诊断某些疾病，如：诊断伤寒、副伤寒病的肥大氏反应（Widaltest）,诊断斑疹伤寒的外-裴氏反应（Weil-Felixtest）。⑵用红细胞凝集试验测定免疫溶血性疾病等人体内血型抗体的效价⑶鉴定人ABO血型单克隆抗体试剂的效价，要求ABO血型抗A抗B单克隆抗体试剂凝集效价≥256。1、血型抗体凝集效价测定⑴材料：①人A型、B型红细胞悬液（一周内采集，无溶血）。②单克隆抗体试剂：抗A、抗B单克隆抗体各一支。③生理盐水、小试管、吸球、吸管、试管架等。⑵方法：①取小试管10支，编号，置试管架上。②用1ml吸管吸生理盐水0.9ml于第一管中，其余管中加入生理盐水0.5ml.③用1ml吸管吸抗A或抗B试剂0.1ml于第一管中，反复吹吸三次，防止起气泡，混匀后吸出0.5ml注入第二管，同样混匀后吸出0.5ml注入第三管中，以此类推，稀释至第九管，第九管混匀后弃去0.5ml，第十管不加抗体试剂。④每管中加入2%A型或B型红细胞悬液各0.5ml。⑤混匀后，37℃放置2小时以上，观察结果。试管凝集操作及结果举例试管号12345678910生理盐水ml抗体(血清)ml抗原(红细胞)ml0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5血清稀释度20408016032064012802560512037℃放置2小时以上结果举例4＋4＋4＋3＋3＋2＋2＋1＋±－⑶结果判定：①第十管为阴性对照，应无凝集现象。②凝集程度以4＋、3＋、2＋、1＋、±、－表示。4＋：血球全部凝集，成1至2块，上清澄清。晃动时，凝集物成片状分散。3＋：血球绝大部分凝集，成大块拌数小块，或数个小块，上清较澄清。2＋：血球约半数凝集，成清楚的小凝块。上清略澄清。1＋：血球少数凝集，成肉眼可确定的小凝块。±：血球很少数凝集，肉眼难判定，光镜下可见凝块。－：无凝集，血球沉淀成边界清楚的圆点，晃动时，分散均匀。③血型抗体凝集效价判定：以肉眼可见凝集（1＋）的血型试剂最高稀释倍数为该试剂凝集效价。表中列举的血型试剂效价为2560。二、间接凝集-抗链球菌溶血素O抗体的检测将小分子可溶性抗原（激素、细菌及寄生虫提取物等）吸附到一种与免疫无关的颗粒性载体（红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等）表面，再与相应抗体结合，能出现肉眼可见的凝集物。因载体的不同，又分别称为间接血凝，间接乳凝，间接炭凝等。间接凝集具有快速、简便、微量等特点，敏感性比直接凝集高2～8倍，可用于检测微量抗原或抗体，如用于梅毒螺旋体、类风湿因子、乙肝表面抗原、抗链球菌溶血素O等的检测。血清中ASO的测定可用于诊断链球菌感染。链球菌感染病人的血清中含有高滴度的ASO，此血清中加入适量的溶血素后，可中和掉正常水平的ASO，多余的ASO可与ASO乳胶试剂反应，出现凝集物。ASO乳胶试剂系羧化聚苯乙烯乳胶与溶血素O共价交联的产物。1、材料：⑴溶血素O溶液，用时摇匀。ASO⑵乳胶试剂，用时摇匀。⑶病人血清、阳性及阴性对照血清。⑷微量反应板、加样器、吸头等。2、方法：⑴血清标本用生理盐水115∶稀释，56℃灭活30分钟以灭活补体。⑵在微量反应板各孔里分别加入50μl稀释灭活血清以及阳性和阴性对照血清，每孔再分别加入50μl溶血素O，轻轻摇动1分钟，使其充分混匀。⑶每孔加入50μlASO乳胶试剂，室温下（18℃～20℃）轻轻摇动3分钟，将微量反应板平放在实验桌上，出现清晰凝集物者为阳性，不出现凝集物者为阴性，阴性者的ASO≤250IU/ml。⑷阳性者的血清进一步稀释为130∶和160∶，再重复步骤2和3，出现凝集的血清稀释度和ASO滴度间的关系大致如下：稀释度115∶130∶160∶ASOIU/ml40080016003、注意事项：ASO⑴乳胶加入后，轻轻摇动到三分钟时应立即记录结果，超过规定时间后再出现凝集者不记为阳性。⑵室温降低10℃，在乳胶试剂加入后应延长反应时间1分钟，室温升高10℃，应缩短反应时间1分钟。⑶溶血、脂血症、高胆红素血症、高胆固醇血症、类风湿因子阳性以及标本被细菌轻度污染都不会影响本试验的结果。⑷乳胶试剂不可冰冻，放置在4℃冰箱保存，有效期可达一年，用前摇匀。三、协同凝集原理：金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）作为无关载体，能与特异性抗体IgG的Fc段结合，使之成为致敏的抗体，再与待检的抗原（细菌、病毒、毒素等）反应后，如果抗原抗体能够结合，金黄色葡萄球菌被动地发生凝集。反之，金黄色葡萄球菌不发生凝集。应用：该法简便、快速，特异性、灵敏性高。常用于病原微生物的快速鉴定。亦可用于淋巴细胞亚群、免疫复合物中的特异性抗原的鉴定。试验1、材料：⑴金黄色葡萄球菌株选用的是国际标准菌株Cowan-1株(ATCC12598或NCTC8530)，不含SPA的对照菌株为Wood46株。0.01mol/LPh7.2PBS⑵。⑶甲醛、NaN3。⑷琼脂培养板、离心机、水浴箱、玻片。2、方法：10%SPA⑴菌体试剂的制备：将标准菌株在琼脂平板上培养18～24小时，用PBS洗下菌苔，3000rpm离心15～20分钟，弃上清。用PBS重悬沉淀，3000rpm离心15～20分钟，弃上清，此为离心洗涤1次，重复此步骤两次，将沉淀重悬于PBS中（含有0.5%甲醛），置于室温3小时后，用PBS再离心洗涤沉淀3次，将沉淀制成10%的细菌悬液（W/V），80℃加热20～30分钟后，用PBS离心洗涤沉淀三次，将沉淀制成10%SPA菌体试剂，加入0.1%NaN3，放4℃可保存3个月。使用前用PBS洗一次。⑵抗体致敏的SPA试剂：取步骤1制备的10%SPA菌体试剂1ml，加入特异性抗体0.1ml，充分混匀，放371℃小时后，置4℃过夜。3000rpm离心15～20分钟，弃上清。用PBS离心洗涤沉淀2次后，制成1%抗体致敏的SPA试剂。同时应制备正常兔血清致敏的SPA试剂。4℃可保存7天。⑶当进行抗原鉴定时，取一洁净玻片，从左至右分别加三滴生理盐水，然后再加入少量的待检细菌悬液及一滴致敏的SPA试剂。具体操作参看下表。待检组对照组1对照组2生理盐水＋＋＋＋待检细菌悬液＋＋＋特异性抗体致敏的SPA试剂＋－－正常兔血清致敏的SPA试剂－－＋⑷充分混匀，放置5分钟后观察结果。3、结果判定：⑴阴性组（－）：对照组1（生理盐水对照组）及对照组2（非特异性抗体对照组）应为阴性，液体混浊，无颗粒状凝集物出现。⑵阳性组（＋＋）：液体澄清，，有颗粒状凝集物出现。四、双向免疫扩散原理：琼脂凝胶含水量大于97%时，形成网状结构，其孔隙可容许大分子物质自由扩散，阻力很小。不同的物质由于它们的化学结构，分子量，扩散系数不同，所以它们在琼脂凝胶中的扩散速度亦有所差别。当抗原抗体加入含有适量电解质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向四周扩散，若两者相互对应，分子比例适合，则扩散一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。如有多对不同抗原抗体同时存在时，便可依各自的扩散速度，在适当部位形成各自独立的沉淀线。应用：可用于疾病的诊断：如检测AFP，乙肝表面抗原等。亦可用于抗原抗体成分的定性，定量及不同种抗原间的相关性分析。但此法需要时间长，灵敏度低。试验1、材料：⑴抗体：抗人全血清抗体。来源：用正常人血清作抗原，免疫家兔而得的抗体。因为正常人血清中含有多种蛋白质，对家兔均有抗原性，能刺激其产生4～5种抗体。⑵抗原：正常人血清、人白蛋白。1.5%⑶琼脂：琼脂粉溶于0.1%石炭酸生理盐水中，置70℃～80℃水浴中保温。⑷玻片、吸管、加样器、打孔器、打孔图形、湿盒（带盖搪瓷盘，底部铺有浸透0.5%石炭酸的纱布）等。2、方法：⑴取洁净玻片，如下图所示，在其左侧1/3处用记号笔划一直线，作标记。标记班，座号112323⑵用吸管吸取融化的琼脂约2.5ml，加在划线右侧的玻片上，使之自然流开，形成厚约2㎜的琼脂层。⑶待琼脂冷凝后，用打孔器按图形打孔，除去孔中琼脂。⑷用加样器吸取抗人全血清抗体放入3号孔中，换吸头后吸取正常人血清（抗原），放入1号孔中。再换吸头吸取人白蛋白（抗原）放入2号孔中。⑸将玻片置湿盒中，放37℃孵箱中，24～48小时后观察结果。⑹标本若想长期保存，应将玻片放入盐水中漂洗2天，每天换水2～3次，烘干，然后用染蛋白质的方法染色。可用氨基黑染料染色，沉淀线染成深兰色；或用偶氮胭脂红染色，沉淀线染成红色。3、结果判定：⑴观察抗原与抗体间是否生成白色沉淀线及沉淀线的数目。如抗原与抗体孔间生成一条沉淀线，说明只有一对抗原抗体特异性结合，而且二者分子比例较适宜。如果出现数条沉淀线，则说明同时有数对抗原抗体各自特异性结合，且分子比例亦较适宜。⑵据1、2孔中抗原的性质及相互间的关系，以及3孔中所含抗体的种类，生成的沉淀线可能出现以下现象：两种抗原完全相同时，相邻的两条沉淀线端部完全融合，见图A。两种抗原完全不同时，相邻的两条沉淀线相交或各自独立。见图B。如果两种抗原有部分相同时，则相邻的两条沉淀线出现相切现象，见图C。正常人血清中含有白蛋白，所以1孔和2孔中的白蛋白抗原和3孔中的相应抗体结合所生成的沉淀线端部融合。正常人血清与抗人全血清抗体生成其它沉淀线，与白蛋白的沉淀线可不发生关系，但也有可能与白蛋白的沉淀线相交。4、注意事项：⑴铺板时，速度要快，要均匀，厚薄一致。⑵加样时，由于孔小，只能放入很少量液体，所以应将加样器吸头插入孔底，缓慢加入液体，直至孔满。⑶一般72小时不出现沉淀线为阴性。⑷孔距过大或过小均影响结果，一