PCR反应体系中各种成分的作用

PCR反应体系中各种成分的作用不同模板浓度的实验结果用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行ＰＣＲ扩增,发现在模板量25ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在25ｎｇ～200ｎｇ之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量200ｎｇ时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μｌ的ＰＣＲ反应体系中,模板ＤＮＡ以25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在200ｎｇ以下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍｇ2+的不良影响程度,应该尽量降低ＤＮＡ模板用量。不同Ｍｇ2+浓度时实验结果设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为10ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增产物;Ｍｇ2+浓度为15～25ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加,ＰＣＲ扩增产物带型基本一致,但以20ｍＭ的扩增效果最好不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响设置5种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在01～02μＭ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0.2μＭ左右为宜。不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响采用2种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以4种不同的ｄＮＴＰ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当ｄＮＴＰ浓度200μＭ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μＭ的ｄＮＴＰ浓度为佳。ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响设置5个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在05ｕ～25ｕ浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以10～15ｕ结果较好不同退火温度下的扩增效果引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响用同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较3种ＭｇＣｌ2浓度与3种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的9个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2在低浓度时,过量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+的螯合作用明显,表现为降低Ｍｇ2+的酶催作用,ＰＣＲ扩增产物减少或无,而低量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+酶催的抑制作用减少,ＰＣＲ扩增产物增多。在高浓度Ｍｇｃｌ2浓度下,ｄＮＴＰ无抑制作用。在相同Ｍｇ2+离子浓度和足量ｄＮＴＰ时,扩增产物相似。1-9泳道分别代表Ｍｇｃｌ2(ｍＭ)/ｄＮＴＰ(μＭ)的浓度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、3/300)。PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加5倍，可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。尿嘧啶－DNA－糖基酶（UDG）就是在pre-PCR阶段用dUTP替代dTTP，UDG存在于反应混合液中，其它所有反应成分保持不变。PCR反应的DNA链延长过程中DNA聚合酶用dU代替了dT，因而产物DNA序列中含有dU而不是dT，在新样品进行反应前，它们首先面临的是UDG。含有U的DNA链一旦遇上UDG，这些U就会被切除而使该链具有缺刻。在接下来的PCR加热过程中，有碱基缺失的DNA链分开后不能够被扩增。因此，UDG的使用赋予热启动一个额外的优点就是它能降解第一轮完整的循环之前形成的所有PCR产物。TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性.TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.TaqDNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性.1,引物和dNTP100ul的反应体系中通常PRIMERS的浓度为0.3uM-3uM之间.dNTPs在37uM-1.5uM.引物为15-25bp.过长或过短非特异性提高.2,模板DNA通常PRIMERS是10倍于DNA模板.如果引物对模板DNA的比例太高,非特异产物会提高,PCR效率降低.传统的PCR模板为50ngDNA.3,退火温度退火温度和引物结合模板的能力.结合力强温度高,反之,温度低.4,延伸温度和时间延伸温度通常为70-75C,时间取决于PCR产物的长度,一般100bp/Sec.1KB片段一般1分钟即可.5.dNTPS该成分为酸性,使用前应该调pH为7.0-7.5,浓度一般为20-200uM.量高,加快反应但降低精确度.6.TAQ酶一般为0.5-5U,依片段长度和复杂性(G/C)不同区别.Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外,也影响引物的退火,模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力明显降低;过高时,酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5～2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA,或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板,会干扰Mg2+的浓度。因此,要适当调整Mg2+的用量。Mg2+浓度优化法:首先须知模板DNA量,引物和dNTP的浓度和设定的PCR循环参数。反应中的PCR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmol/LMgCl2贮存液中逐一加入反应管中。开始以0.5mmol/L递增(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5～5.0mmol/L),在确定了Mg2+的适宜浓度以后,再以0.2mmol/L递增和递减n个浓度,来确定Mg2+的最适浓度。dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20～200μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。在PCR反应中,使用低dNTP浓度,可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例