菊花中绿原酸超声提取工艺与测定方法研究

龙源期刊网菊花中绿原酸超声提取工艺与测定方法研究作者：司超姚晓芹贺学礼楚建周来源：《江苏农业科学》2015年第04期摘要：采用正交试验，考察提取显色条件对药用菊花中绿原酸提取与测定的影响。结果表明，菊花中绿原酸提取测定最优方法为用80%甲醇作提取剂，超声提取30min，加0.02mol/LFeCl30.5mL进行显色反应，静置30min后在分光光度计755nm波长下测定吸光度，该方法简单、准确、灵敏、重复性强，可用于菊花中绿原酸的提取测定。关键词：菊花;绿原酸;超声提取;分光光度法中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）04-0264-03收稿日期：2014-05-09基金项目：国家自然科学基金（编号：31300321）;河北省自然科学基金（编号：C2012201080）;河北大学大学生科技创新项目（编号：2013080）。作者简介：司超（1985—），女，山东滕州人，硕士研究生，主要从事药用植物次生代谢研究。E-mail：[e-mail]。通信作者：姚晓芹，博士，副教授，主要从事药用植物次生代谢、植物逆境生理研究。E-mail：[e-mail]。菊花为多年生菊科草本植物，以头状花序入药，是我国传统中药，主要功效有散风清热、平肝明目、解毒、降压等，主治风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、明目昏花等症[1]。绿原酸是菊花主要的活性成分，它是植物体在有氧呼吸过程中合成的一种苯丙素类物质，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效[2-3]。目前，提取药用植物中绿原酸采用的方法主要有超高压提取法、热回流法、溶剂浸提法、酶解法、微波辅助萃取法、超声提取法等[4-7]。绿原酸含量测定方法主要有高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、紫外分光光度法等[8-10]。有学者利用可见分光光度法测定绿原酸含量，该方法主要是利用绿原酸能与FeCl3进行特殊的显色反应来测定植物中绿原酸含量，具有原理简单、仪器常见、成本低等优点[11]。笔者在前人研究的基础上对超声提取、显色条件进行深入研究，进一步完善采用可见分光光度法快速测定植物中绿原酸含量的方法。1材料与方法1.1仪器与试剂龙源期刊网主要仪器：722型可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），240WPS-40A型数控超声波清洗器（深圳市康洁洗净电器有限公司）。主要试剂：标准绿原酸（纯度95%，阿拉丁试剂上海有限公司）、FeCl3溶液、甲醇、乙醇。笔者所在实验室种植的怀菊，将菊花头状花序在105℃下杀青30min，55～60℃下烘干至恒质量，粉碎、过筛，混匀备用。1.2超声波提取条件优化1.2.1提取溶剂用60%甲醇、60%乙醇进行提取溶剂试验，比较不同提取剂对绿原酸提取效果的影响。取0.3g干样，分别加入15mL60%甲醇、15mL60%乙醇溶液，超声提取30min，过滤后用提取溶剂定容至25mL刻度管内;取1mL上述溶液加4mL提取溶剂，置于10mL刻度管中，加0.5mL0.02mol/LFeCl3溶液（分别用60%甲醇、60%乙醇配制）振荡摇匀后静置60min，用722型分光光度计于755nm波长下进行比色，确定最佳提取溶剂。1.2.2提取容器选择等容积的烧杯、锥形瓶、塑料瓶、试管进行试验，提取溶剂为60%甲醇溶液，提取方法、测定步骤同“1.2.1”节，比较提取容器对绿原酸提取效果的影响。1.2.3浸泡时间用甲醇提取液分别浸泡样品0、3、6、12、18、24h后进行超声提取，测定方法同“1.2.1”节，比较浸泡时间对绿原酸提取效果的影响。1.2.4提取时间用甲醇提取液分别超声提取样品10、20、30、40、50、60min，测定方法同“1.2.1”节，比较超声提取时间对绿原酸提取效果的影响。1.2.5提取次数用甲醇提取液分别经超声波提取样品1、2、3、4次，每次时间10min，每次加入最佳提取溶剂5mL，提取完成后合并每次的提取液，过滤并定容，测定方法同“1.2.1”节，比较提取次数对绿原酸提取效果的影响。1.2.6提取溶剂浓度分别用20%、40%、60%、80%、100%甲醇溶液提取样品，其他条件为已选出的最佳条件，测定方法同“1.2.1”节方法，比较不同浓度甲醇提取液对绿原酸提取效果的影响。1.3显色条件优化配制0.01、0.02、0.03mol/LFeCl3-甲醇显色溶液，显色时分别在样品液中加入0.5、1.0mL进行试验，提取条件采用“1.2”节的优化条件。1.4正交试验在提取、显色条件优化试验结果基础上设计正交试验，选出最优水平组合。选取对测定结果影响较大的2个因素，即提取剂浓度、显色剂用量进行正交试验。1.5标准溶液的配制龙源期刊网，加入最佳提取溶剂溶解并定容至50mL，制成200μg/mL标准液。在7个10mL刻度管内分别加入0、1、2、3、4、5、6mL标准贮备液，用80%甲醇稀释至标线，分别制成0、20、40、60、80、100、120μg/mL标准液。按“1.3”节优化结果进行显色、测定。2结果与分析2.1超声波提取条件优化2.1.1提取溶剂对绿原酸提取效果的影响绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，分子结构中有酯键、不饱和双键、多元酚3个不稳定部分，可以利用甲醇、丙酮、乙醇等极性溶剂从植物中提取出来。笔者分别以甲醇、乙醇为提取溶剂进行试验，试验过程中发现，以乙醇为提取剂在显示过程中容易出现沉淀，因此下面其他优化试验都用甲醇作为提取溶剂。2.1.2提取容器对绿原酸提取效果的影响由表1可知，试管提取效果最佳，另外，利用试管作为提取容器操作更方便。因此，本试验选用试管作为提取容器。表1不同容器对绿原酸提取效果的影响容器D755nm烧杯0.188±0.005b锥形瓶0.181±0.007ab塑料瓶0.189±0.009ab试管0.211±0.004a注：同列数据后标有不同小写字母表示差异显著（P0.05）。下表同。2.1.3样品浸泡时间、提取时间、提取次数对绿原酸提取效果的影响由表2至表4可知，浸泡时间、提取时间、提取次数3个因素对绿原酸提取没有显著影响，因此选择不浸泡，超声提取1次，提取时间为30min。2.1.4提取溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响由表5可知，甲醇浓度对菊花中绿原酸的提取效果有显著影响。提取表2浸泡时间对绿原酸提取效果的影响浸泡时间（h）D755nm龙源期刊网±0.009b180.162±0.004ab120.166±0.002ab60.168±0.003ab30.167±0.003ab00.178±0.003a表3提取时间对绿原酸提取效果的影响提取时间（min）D755nm600.213±0.002a500.192±0.011a400.195±0.008a300.202±0.003a200.184±0.010a100.205±0.006a表4提取次数对绿原酸提取效果的影响提取次数（次）D755nm40.189±0.002a30.183±0.002a20.163±0.004b10.160±0.007b液吸光度随甲醇浓度的增加而增大。当甲醇浓度≤60%时，提取液吸光度随着浓度的增加变化比较剧烈，当甲醇浓度60%时，提取液吸光度变化比较平缓，并且80%、100%甲醇处理对绿原酸的提取效果差异不显著。龙源期刊网提取溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响甲醇浓度（%）D755nm200.028±0.003d400.078±0.006c600.195±0.004b800.218±0.000a1000.222±0.003a2.2显色条件优化表6表明，当显色剂浓度为0.01mol/L、用量为0.5mL时，样品产生沉淀，这可能是因为FeCl3含量不足;当显色剂浓度为0.02mol/L、用量为0.5mL时，吸光度最大;当显色剂浓度为0.03mol/L时，吸光度显著降低。表6显色剂浓度及用量对绿原酸提取效果的影响显色剂浓度（mol/L）显色剂用量（mL）D755nm0.010.50（沉淀）1.00.165±0.004b0.020.50.182±0.004a1.00.101±0.002d0.030.50.136±0.003c1.00.077±0.001e2.3正交试验结果龙源期刊网选取对绿原酸提取、显色影响明显的因子进行正交试验。以提取剂浓度、0.02mol/L显色剂FeCl3的用量为考察因素，设计正交试验（表7、表8）。由此可知，最优水平组合为A2B2，即甲醇浓度80%，显色剂用量0.5mL。表7正交试验因素水平水平因素A：提取剂浓度（%）B：显色剂用量（mL）1600.252800.5031000.7541.00表8正交试验结果与极差分析序号因素水平A：提取剂浓度B：显色剂用量吸光度1110（沉淀）2120.206±0.001d3130.170±0.002e4140.154±0.002f5210.269±0.004a6220.239±0.003b7230.224±0.002c龙源期刊网±0.003c9310.240±0.004b10320.239±0.003b11330.240±0.004b12340.237±0.005bk10.1770.127k20.3160.171k30.3190.159k40.152极差R0.1420.0442.4标准曲线取不同浓度标准液5mL，加入显色剂FeCl3-甲醇溶液0.25mL充分振荡，静置30min后于波长755nm下比色，以80%甲醇加显色剂作参比调零。以吸光度为纵坐标、相对应的绿原酸浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y=0.0023x-0.0104，r2=0.9959（图1）。2.5加标回收率称取菊花干样粉末6份，每份0.3g，按正交试验筛选出的最优条件进行提取，取6支试管，分别加入提取液0.5mL、60μg/mL标液0.5mL，定容至5mL，加0.25mL显色剂进行显色，利用分光光度分析加标率直接计算数学模型[12]，得出平均回收率为100.83%。2.6精密度对120μg/mL标准溶液连续测定20次，测得样品中绿原酸吸光度RSD值为0.22%，符合相关规定，表明试验精密度很好。2.7重复性称取5份样品，每份0.3g，按照优化条件进行提取测定。经计算RSD值为1.10%，表明试验重复性符合有关规定。3结论龙源期刊网与常规提取方法相比，超声波提取法具有操作简单、溶剂用量少、提取时间短、对环境污染小、被提取活性物质不易被破坏、提取率较高等优点[13]。酚类物质与FeCl3发生显色反应，能够用来检验酚羟基的存在，并对绿原酸进行简单快速的定量分析[14]。本试验综合考虑了与测定相关的提取及显色因子，结果表明，菊花中绿原酸提取测定最优方法为用80%甲醇作提取剂，超声提取30min，加0.02mol/LFeCl30.5mL进行显色反应，静置30min后，在可见分光光度计755nm波长下测定吸光度。本方法成本低、简便易操作、精密度好、重复性强，可用于菊花中绿原酸的提取测定。参考文献：[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1979.[2]李永霞.湖北产不同品种菊花中绿原酸的含量测定[J].湖北中医杂志，2006，28（2）：48-49.[3]陈绍华，王亚琴，罗立新.天然产物绿原酸的研究进展[J].食品科技，2008，33（2）：195-199.[4]秦霞，靳学远，刘红.菊花中绿原酸的超高压提取工艺研究[J].湖北农业科学，2010，49（9）：2215-2217.[5]符玲，毕跃峰，田新慧，等.野