发酵操作方式及其动力学特征

发酵菌种的选育发酵培养基设计灭菌工程无菌空气制备发酵种子扩大获得特定代谢特征的微生物提供满足代谢要求的基质组合营造适应纯培养的环境维持无菌状态及耗氧的需求制备符合发酵需要的催化剂发酵过程进程发酵操作方式发酵过程控制发酵反应器发酵操作方式及其动力学特征教学内容参见教材p95-119发酵过程按操作方式区别一般分为3个基本类型分批发酵连续发酵补料分批发酵一、分批发酵（Batchfermentation)•1、定义：将发酵培养基一次性投入发酵罐，接种发酵后再一次性地将发酵液放出的一种间歇式发酵操作方式。准封闭式的系统非稳定的过程使用最广泛的方式2、特点菌种活化摇瓶配料灭菌空气除菌种子发酵发酵液（1）发酵动力学研究微生物生长、产物合成、底物消耗之间动态定量关系，定量地描述细胞生长和产物形成过程规律。4、分批发酵动力学0246810121416051015202530354045发酵时间/h基质浓度、菌体深度/g/L01234567产物浓度/g/mL还原糖浓度菌体浓度产物浓度（2）发酵动力学研究的基本过程•寻找过程变化的理化参数。•分析参数变化与发酵代谢之间的规律。•建立数学模型描述参数间变化的关系。•在线控制，验证和修饰模型。（3）分批发酵动力学a.细胞生长动力学b.基质消耗动力学c.产物形成动力学a、细胞生长动力学分批发酵微生物典型生长曲线通常以单位细胞浓度或细胞数量在单位时间内的增加量即比生长速率来表示（μ或μn）：dtdXX1dtdNNn1或tteXX0ttneNN0或X—细胞浓度（g/L）；N—细胞个数；t—生长时间；X0、Xt—初始微生物浓度和t时细胞浓度；N0、Nt—初始细胞个数和t时细胞个数；—以细胞浓度表示的比生长速率；—以细胞数量表示的比生长速率。n微生物生长速率表示lag:x不变,即exp:(假定无抑制作用存在)0,0dtdx00lnln1xxtxxdtdxxmmmtme00XeXXttDecline（开始出现一种底物不足的限制）:如果不存在抑制物时Monod模型:sKssmtsKsxxsm0lnlntexx0式中:S—限制性基质浓度，mol/LKs—底物亲和常数,mol/L；Ks越大，亲和力越小，µ越小。①当S较高时，(对数期满足S10Ks)，此时，µ=µm②当S较低时，(减速期，S10Ks)，此时S↓，µ↓∴减速期，µ↓dtdXX1Stationary（不生长或生长率与死亡率相等）:dying:atxxmlnlnatmexxmax01xxdtdxx，（浓度最大）a(比死亡速率，s-1)dtdXX1假定整个生长阶段无抑制物作用存在，则分批发酵过程中微生物生长动力学可用阶段函数表示如下：0x0（0tt1)µmx0eµmt(t1tt2)µ=x=eµt(t2tt3)0xm(t3tt4)-axme-at(t4tt5)sKssm培养液中有抑制物的情形①高浓度基质抑制存在的情况下式中，Kis为抑制常数，抑制作用越强，Kis越小isSmKSSK//1②高浓度产物抑制的情况下)1(kPSKSSm)exp(kPSKSSm)(21kPkSKSSm线性指数产物积累一定量才有抑制作用其中：k，k1，k2为常数CBAXS0初始底物浓度菌体浓度A:B:C:培养基中存在多种限制性营养物Monod方程可修整为122221111max1innnnKiSKSKSKSKSKSK•得率系数：指消耗单位营养物所生成的细胞或产物数量。其大小取决于生物学参数（µ,x）和化学参数（DO,C/N,磷含量等）生长得率系数①Yx/s、Yx/o、Yx/kcal：消耗每克营养物、每克分子氧以及每千卡能量所生成的细胞克数；②Yx/c、Yx/N、Yx/p、Yx/Ave-：消耗每克C、每克N、每克P和每个有效电子所生成的细胞克数；③Yx/ATP：消耗每克分子的三磷酸腺苷生成的细胞克数。B、基质消耗动力学消耗每克营养物（s）或每克分子氧(O2)生成的产物(P)、ATP或CO2的克数。sCOsATPOPYYY///p/s22,,,Y产物得率系数：•表观得率专一性得率（纯利率）*专一性用于生长的底物量△S`，不含用于维持能耗及产物形成部分的用量。sxYSX/spYSP/'sxYG'sPYP基质消耗速率与生长、合成关系：表观：专一性：SXSXSXYxdtdxYdtdsdtdsYdtdx///1dtdpYdtdsdtdsYdtdpSPSP//1dtdpYmxYxdtdsPG1m为维持因子•为了扣除细胞量的影响，•基质比消耗速率产物比生成速率dtdsxqS1dtdPxqP1SqPPGYqmYSqSXY/dtdpYmxYxdtdsPG1SXSXYxdtdxYdtds//1SPpsYqq/dtdpYdtdsSP/1SXY/PPGYqmYSPPYq/=若生长阶段产物生成可以忽略，即0PPYqmYYGSX11/图解法求微生物的本征参数YG和m1/Yx/s1/µ1/YGmGSXYmY11/0GYPPSPqmYY11/若生产阶段微生物生长可以忽略，即SXY/PPGYqmYSPPYq/=0GY图解法求微生物的本征参数Yp和m1/Yp/sPPSPYqmY11/1/qpm1/YP根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系：与生长相关→生长偶联型与生长部分相关→生长部分偶联型与生长不相关→无关联C、产物形成动力学产物合成相关、部分相关、非相关模型动力学示意图与生长相关→生长偶联型：乙醇发酵XPPxXPYqdtdxYdtdP//1/产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行。与生长部分相关→生长部分偶联型：柠檬酸、氨基酸发酵PqxdtdxdtdP产物间接由能量代谢生成，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物（与初生代谢紧密关联）。与生长不相关→无关联：抗生素发酵pqxdtdP若考虑到产物可能存在分解时，则PkxqPkxdtdPdpd产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞进行的独特的生物合成反应而生成。5、分批发酵的优缺点优点：操作简单、投资少运行周期短染菌机会减少生产过程、产品质量较易控制缺点：不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应及二次生长现象。对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等不适合用分批发酵.养分耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产非生产时间长，生产率较低二、补料分批发酵（Fed-batchculture）•1、定义：指在分批发酵过程中，间歇或连续地以某种方式向培养系统中补加一定物料不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐渐增加的发酵生产技术。•2、特点：稀释率、比生长速率以及其它与代谢有关的参数都将发生周期性的变化。3、补料分批发酵类型补料方式连续流加不连续流加多周期流加快速流加恒速流加变速流加流加方式单一组分补料多组分补料补加的培养基成分•整个发酵罐中细胞、限制性基质和产物总量的变化速率可用下式表示：①②③xVdtxVdSXYFSdtSVd/01xVqdtPVdP4、补料分批发酵动力学dtxVdV：补料体积，L；F：补料流量，L/min•细胞总量的变化率为•④若为恒速流加，培养基流量为F，则⑤合并①、④、⑤式得dtdVxdtdxVdtxVdFdtdVxFdtdxVxVxDxVFdtdx)()(同样可以推导出限制性基质和产物浓度的变化率：SFdtdSVdtdVSdtdSVdtSVdSXYFS/01dtxVdSFdtdSV⑥合并②、⑥式得xVdtxVdSXYxSSDdtdS/0xVqdtdPVFPdtdPVdtdVPdtPVdP又∵∴拟稳态时这时•对于恒速流加，细胞的比生长速率对时间的变化率为：•长时间流加培养之后20222FtVFVFVFdtddtd21tdtd•可以解除底物的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。•避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。•菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。5、补料发酵的优点三、连续发酵(continuousfermentation)1、定义当发酵过程启动到一定阶段（产物合成最适时期）一边连续补充发酵培养液，一边又以相同的流速放出发酵液，维持发酵液的原先体积的操作方式。•2、特点添加培养基的同时，放出等体积发酵液，形成连续生产过程，获得相对稳定的连续发酵状态。•3、类型单级多级连续发酵4、连续发酵类型及装置（1）罐式连续发酵a.单级b.多级串联单级连续发酵示意图多级罐式连续发酵装置示意图α:再循环比率（回流比）c:浓缩因子细胞回流的单级连续发酵示意图C.细胞回流式发酵罐培养物流出培养基流入(2)塞流式定义：①稀释率D=F/V(h-1)F—流量（m3/h）V—培养液体积（m3）②理论停留时间细胞的物料衡算（µ和D的关系）积累的细胞（净增量）=流入的细胞-流出的细胞+生长的细胞-死亡的细胞对于单级恒化器：X0=0且通常有：xxDxDxxdtdxxVFxVFdtdxG00DTL1单级恒化器连续发酵xDdtdx0dtdxxdtdx,0xdtdx,0xDdtdxA.稳定状态时，此时µ=D（单级连续发酵重要特征）B.不稳定时，当µD，当µD，积累的营养组分=流入量-流出量-生长消耗量-维持生命需要量-形成产物消耗量稳态时，=0,一般条件下,mx产物相对菌体生长量较少,SPPSXYxqmxYxSVFSVFdtds//0SXYx/0/SPPYxqSXYxSSD/0限制性基质的物料衡算dtds稳态时,单级连续培养两个稳态方程是：SSYxDSX0/SSYxDSX0/限制性基质的物料衡算SXYxSSD/0两个稳态方程隐含了几点假设：Yx/s对于一个特定微生物及具体操作参数(D)来讲是常数Yx/s只受一种限制性营养基质S的影响：S一定，µ一定，则Yx/s一定mY1Y1GS/X•细胞浓度与稀释率的关系（x与D的关系）–临界稀释率Dc•导致菌体开始从系统中洗出时的稀释率，当流入底物浓度为S0时，临界稀释率Dc为：00SKSDSmC稀释率D的大小不能超过连续发酵系统的临界稀释率CSmsmDSKSSKSD00•如果取DDC，则会出现：DDCµ•由可知负增长，x↓，进入非稳态，菌体最终被洗出，即x=0时，达到“清洗点”，此时，xDdtdx0dtdx00SKSDSmC生长模型•由两个稳态方程可以推出D与X关联的生长模型当DDC时，细胞衡算底物衡算DDKSSKSDmSSmSSYxSX0/DDKSYxmSSX0/•细胞生产率当即时DDKSDYDxmSSX0/,0dDdDx01SKKDSSm可获得最大的细胞生产率，为20000/SKSSKSYDxSSmSXm细胞生产率•若S0Ks（S010Ks）,底物供给浓度很大，为非限制性则此时，最大临界稀释率∴当DD