琼脂糖凝胶电泳检测DNA

2020/5/192003级《分子生物学实验》哺乳动物基因组DNA的提取实验一储备液的制备实验二破碎细胞实验三分离、纯化DNA实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA2020/5/192003级《分子生物学实验》一、实验目的通过本实验了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和步骤。通过本实验熟练掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术。熟练掌握分子生物学实验中各种仪器的使用方法及试剂的配制方法。2020/5/192003级《分子生物学实验》二、实验原理天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等。在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA。用此方法得到的DNA大小为100-150kb，适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern分析。2020/5/192003级《分子生物学实验》三、仪器、材料和试剂（一）仪器高速冷冻离心机、微量取样器、玻璃匀浆器、琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪（或凝胶成像分析系统）、恒温水浴器、高压灭菌锅、超净工作台、超低温冰箱、电子天平、酸度计2020/5/192003级《分子生物学实验》（二）实验材料、用具、药品1.鼠肝或兔肝2.1.5mL微量离心管、微孔过滤器、20mL注射器、各种型号的吸头3.三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸钠（NaAc）、平衡酚、氯仿、异戊醇、乙醇、琼脂糖、蛋白酶K、RNA酶、DNA相对分子质量标准物、硼酸、溴酚蓝、蔗糖溴化乙锭（危险）2020/5/192003级《分子生物学实验》（三）试剂1.5mol／LNaCl2.0.5mol／LTris.HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.3mol／LNaAcpH5.25.dddH2O6.生理盐水（0.85％NaCl）以上均高压灭菌2020/5/192003级《分子生物学实验》7.10mg／mL蛋白酶K配好后用一次性过滤器过滤，-20℃保存；8.10mg／mL无DNA酶的RNA酶配好后用一次性过滤器过滤，-20℃保存；9.组织匀浆液10.酶解液11.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇＝25：24：112.提取液2：氯仿：异戊醇＝24：113.5×TBE14.TE缓冲液15.6×凝胶加样缓冲液2020/5/192003级《分子生物学实验》四、实验步骤本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝或兔肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。2020/5/192003级《分子生物学实验》（一）储备液的制备（第一次）1.5mol／LNaCl2.0.5mol／LTris.HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.3mol／LNaAcpH5.25.dddH2O6.生理盐水（0.85％NaCl）以上均高压灭菌7.10mg／mL蛋白酶K-20℃保存8.10mg／mL无DNA酶的RNA酶-20℃保存9.5×TBE10.6×凝胶加样缓冲液2020/5/192003级《分子生物学实验》（二）破碎细胞（第二次）冰浴处理生理盐水玻璃匀浆器冰冷的生理盐水清洗配制工作液处死小鼠取出肝脏组织匀浆液酶解液2ml匀浆液组织细胞液玻璃匀浆器匀浆移至1.5ml离心管5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul离心无菌水酶解液水浴处理（55℃、12—18h）2020/5/192003级《分子生物学实验》（三）分离、纯化DNA（第三次）等量分装在两支离心管内加入20ul的RNase加入等体积①提取液500ul4℃10min酶解样品待抽提的样品抽提静置离心配制TE缓冲液加等体积②提取液500ul10000r／min离心10min4℃10min移出水相至离心管抽提静置10000r／min离心10min加1/10加2倍放入离心移出水相NaAc无水乙醇-75℃1-2h12000r／min离心15min加入超低温冰箱融化、离心弃上清液洗涤12000r／min离心15min干燥4℃75%冷乙醇离心弃上清液加TE存放DNA2020/5/192003级《分子生物学实验》（四）琼脂糖凝胶电泳检测DNA（第四次）制备琼脂糖凝胶胶板的制备加样电泳紫外投射仪检测DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中由负极向正极移动。2020/5/192003级《分子生物学实验》1.计算方法:（1）摩尔质量的计算:质量(g)分子量5mol／LNaCl分子量58.44x58.44（2）组织匀浆液：10ml5mol／LNaCl100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10ml0.2ml÷体积(L)＝摩尔体积（mol/L）÷0.5(L)＝5（mol/L）x＝146.1（g）2020/5/192003级《分子生物学实验》2.溶液的配置（1)3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）：溶解20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，并溶于约40ml水中，定容至50ml。(3)5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解14.6g氯化钠于足量的水中，定容至50ml。2020/5/192003级《分子生物学实验》(4)10％十二烷基硫酸钠（SDS）：称取10gSDS慢慢转移到约含90ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至100ml。(5)10N氢氧化钠（NaOH）：溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L盐酸（HCl）：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。2020/5/192003级《分子生物学实验》(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）2020/5/192003级《分子生物学实验》(9)Tris缓冲液（Tris-HClbuffer）将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。浓盐酸的体积（ml）pH148.62128.53846566671.3769.08.88.68.48.28.07.87.67.47.22020/5/192003级《分子生物学实验》5×TBE（电泳缓冲液）100mL5.4gTris，2.75g硼酸，2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)加蒸馏水到100mL（1000ml）pH8.02020/5/192003级《分子生物学实验》6×上样缓冲液0．25％溴酚蓝：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中40％(W／V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖2020/5/192003级《分子生物学实验》破碎细胞1．取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。2020/5/192003级《分子生物学实验》2．将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000r／min离心30—60s，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次。2020/5/192003级《分子生物学实验》3．沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12—18h。2020/5/192003级《分子生物学实验》分离、纯化DNA4．取20uLRNase加入1.5ml离心管内，使RNase至终浓度200μg／mL，37℃水浴1h。5．将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积①提取液酚／氯仿／异戊醇500ul，抽提(慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)一次。4℃10min静置，然后10000r／min离心10min。2020/5/192003级《分子生物学实验》6.有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)。7.然后加等体积②提取液氯仿／异戊醇500ul，抽提，4℃10min静置，然后10000r／min离心10min(若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6，7操作)。2020/5/192003级《分子生物学实验》8.用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)。9.再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-75℃1-2h。2020/5/192003级《分子生物学实验》10.12000r／min离心15min，弃上清。11.75％冷乙醇洗涤一次，12000r／min离心15min。12.室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入50μLTE缓冲液。13.存放于4℃，轻摇溶解过夜(或2h)，即可得到实验动物基因组DNA。2020/5/192003级《分子生物学实验》琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）哺乳动物基因组DNA提取检测的电泳胶制备A.支持胶：1％琼脂糖称取0.4g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入40mL，0.5×TBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。B.电泳胶：0.3％琼脂糖称取0.18g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入60mL的0.5×TBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为0.3％琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用双蒸水补足）2020/5/192003级《分子生物学实验》2020/5/192003级《分子生物学实验》（2）胶板的制备①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在槽内底部放上玻璃，然后再放好样品梳子。③先用2.5％琼脂糖凝胶液将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。2020/5/192003级《分子生物学实验》④将熔化的琼脂糖凝胶液转入EB专用的三角瓶中，然后加入10mg/ml的EB4ul至终浓度0.5ug/ml。⑤将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒人有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。⑥待胶凝固后（60min），取出梳子，取下有机玻璃片，放在电泳槽内。⑦加入电泳缓冲液(0.5×）至电泳槽中。2020/5/192003级《分子生物学实验》（3）加样1.样品DNA：16ul2.上样缓冲液：4ul1.MarkDNA样品：6ul共20ul2020/5/192003级《分子生物学实验》（4）电泳①接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压190V。②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。2020/5/192003级《分子生物学实验》（5）实验结果在紫外灯(312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶(图实验12—1)。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用)。结果照片图2020/5/192003级《分子生物学实验》五、