Venusil-AA-氨基酸分析方法包使用说明书

VenusilAA氨基酸分析方法包使用说明书博纳艾杰尔科技推出的VenusilAA氨基酸分析方法是基于目前广泛使用的PITC（异硫氰酸苯酯）衍生剂的HPLC氨基酸分析方法。简化了衍生方法，衍生方便、快速，衍生物单一、稳定，-20℃可贮存数月；4℃水溶液3天；分析时间短；结果准确，试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速蒸发去除；紫外检测（254nm）灵敏度高，可达到1pmol；一、二级氨基酸均可检测。是目前氨基酸分析中最具吸引力的分析方法。本法已拓展至磷酸氨基酸、硫酸氨基酸等修饰氨基酸与不同组织氨基酸分析。组件清单1.VenusilAA氨基酸分析专用柱:（4.6×250mm，5μm）×1支2.氨基酸标准溶液：1mL×2瓶（含有17种氨基酸:天门冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、丝氨酸Ser、甘氨酸Gly、组氨酸His、精氨酸Arg、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Ty、缬氨酸Val、蛋氨酸Met、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、赖氨酸Lyb各为2.5μmol/mL胱氨酸Cys为1.25μmol/mL）3.内标物正亮氨酸（Nle）：100mg×1瓶4.异硫氰酸苯酯（PITC）：25μL×10瓶5.三乙胺（TEA）：1.4mL×2瓶测定方法一、溶液配制(1)1.三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6mL，混匀。2.异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL混匀。3.流动相A：称取15.2g无水乙酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140mL，混匀，用0.45μm滤膜过滤流动相B：80%乙腈水溶液4.正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L盐酸溶液10mL使溶解，混匀。天津博纳艾杰尔科技有限公司客服：400-606-8099网址：邮箱:[e-mail]地址：天津开发区西区南大街179号，300462电话：[phone]传真：[phone]二、样品水解方法：1.酸水解法：准确称取一定量样品，使样品氨基酸总量在50～75mg范围内,置于20～30mL安瓿瓶中，加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L盐酸,振摇使样品溶解或使样品均匀分散于溶液中，将安瓿瓶置-20℃冰箱中冷冻3～5min，充氮后用喷灯熔封，然后置110±1℃烘箱中水解24小时取出冷却，取水解液1mL，置浓缩管中浓缩仪浓缩至干（或用氮气吹干去除盐酸），加入1mL的0.1mol/L稀HCl溶解，用0.45μm滤膜过滤后，取清液贮于冰箱中，供衍生使用。2.碱水解法：准确称取一定量样品，使样品氨基酸总量在50～75mg范围内，置于聚四氟乙烯衬管中，加4mol/L氢氧化锂溶液1.50mL（称取一水合氢氧化锂16.78g用水溶解并稀释至100mL，使用前取适量超声或通氮脱气)于液氮中冷冻，而后将衬管插入水解玻管，抽真空至7Pa(≤5×10-2,mm汞柱)，封管。然后，将水解管放入(110士1)℃恒温干燥箱，水解20小时。取出水解管，冷至室温，开管，将水解液定量地转移到50mL容量瓶中，加入6mol/L盐酸溶液1.00mL中和，并加水定容刻度。用0.45μm滤膜过滤后，取清液贮于冰箱中，供衍生使用。*注：若样品颗粒较大，则在称样前应对样品粉碎，过孔径为0.25mm的样品筛，并充分混匀。另外若在试样提取过程中，过滤太慢，也可离心10min(4000r/min)。三、氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生(2)1.准确量取氨基酸标准溶液及样品200μL，分别置于1.5mL离心管中。2.往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20μL。3.分别加入三乙胺乙腈溶液100μL、异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL至每个离心管中，混匀，室温放置1小时。4.然后加入正己烷400μL至各离心管，振摇后放置10min。5.取下层溶液(PTC-AA)，用0.45μm针式滤器过滤。6.取滤液200μL，加800μL水稀释，摇匀，进样10μLVenusilAA氨基酸分析方法包使用说明书天津博纳艾杰尔科技有限公司客服：400-606-8099网址：邮箱:[e-mail]地址：天津开发区西区南大街179号，300462电话：[phone]传真：[phone]五、计算公式样品溶液中各种氨基酸浓度(μg/mL)=f1/f2×C其中：f1=样品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积f2=混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积C=氨基酸对照品浓度(μg/mL)样品中总氨基酸含量(%)=样品溶液中所有氨基酸浓度总和(μg/mL)×V×10-6×100/W其中：V＝样品溶液的定容体积（mL）W＝样品质量（g）时间(min)0143333.024141.0249　　B(%)0203410010000Waters1525四、色谱检测min0510152025mAU700300100200300400500600LysIlePheTyrAspGluSerGlyHisArgrAlaProValMetLeuCysNleTh岛津LC-20AD时间(min)02142932333939.145B(%)007305010010000Agilent1100B(%)0010304510010000时间(min)0215253333.13838.145时间(min)01113.9142929.023737.0245B(%)0712153410010000岛津LC-10AD/AT注解：(1)各试剂建议保存条件和时间：PTC-AA：密闭，-20°C，保存24小时；异硫氰酸苯酯乙腈溶液：密闭，4°C，可放置7天；异硫氰酸苯酯（PITC）：充氮，密闭，-20°C，保存1年；氨基酸标准溶液：密闭，-20°C，保存6个月，密闭，4°C，可保存2个月。※请遵循建议试剂保存条件和时间，以获得最佳分离效果。(2)氨基酸标准溶液和样品溶液的总氨基酸浓度应不超过4.0mg/mL，否则应对氨基酸标准溶液或样品溶液作适当的稀释。(3)因各厂家HPLC仪器结构差异，博纳艾杰尔公司提供的梯度洗脱条件仅供参考，请根据仪器实际情况调整梯度洗脱条件。(4)氨基酸测定视频地址：=422典型的18种氨基酸分离参考色谱图色谱柱：VenusilAA氨基酸分析柱4.6×250mm,5μm；柱温：40℃；进样量：10μL；波长：254nm；流速：1.0mL/min；其中Nle为正亮氨酸内标流动相梯度（3）