29定量PCR基本原理

1TheworldleaderinservingscienceModule1：实时荧光定量PCR技术原理陈涛FieldApplicationScientistTel:8008208982/40082089822什么是实时荧光定量PCR?•一种实时监控核酸扩增的技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。3定量PCR如何工作?一个PCR循环•PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物4PCRPCR大量PCR产物PCR产物定量PCR如何工作?•在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强5•所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分定量PCR仪如何工作?1.热循环模块2.光路系统3.检测器6定量PCR如何工作?•每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加循环1滤光片A样品1Level:7•最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析定量PCR如何工作?8定量PCR的数学原理9指数增长期线性增长期平台期对数图谱线性图谱PCR动力学曲线和四个阶段基线期10可变的平台期96次重复循环数指数增长期内重复性好荧光信号指数增长期内扩增曲线具有高度重复性11基线阈值线Ct值∆RnCycles定量PCR扩增曲线的各种概念12对数图谱线性图谱什么是基线？•基线是扩增曲线的水平部分基线基线13基线扣除BeforesubtractionRnAftersubtractionDRn14对数图谱线性图谱什么是阈值？•阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线阈值阈值线阈值阈值线15对数图谱线性图谱•Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值什么是Ct值？CtCt16如何使用Ct值计算结果?绝对定量LogcopynumberCtvalues01234567相对定量17定量PCR的化学原理18染料法TaqMan探针法两种化学方法19•TaqMan水解探针：5′端荧光报告基团与靶基因特异性结合的序列3′端荧光淬灭基团TaqMan探针法报告基团淬灭基团20能量•完整的探针：检测不到报告荧光TaqMan水解探针作用机理激发光激发光•切断的探针：检测到报告荧光荧光共振能量转移，FRET21变性(95ºC)22退火(60ºC)232425262728?295′-3′外切酶活性水解探针，使报告基团和淬灭基团分离3031323334353637383940414243444546474849Burp!50实时记录每个循环后荧光信号的变化荧光循环数51报告荧光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、TexasRed、CY5淬灭荧光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ参比荧光:ROX常用的荧光组合：FAM目的基因1VIC目的基因2/内对照NED目的基因3ROX参比荧光荧光标记组合52荧光染料组合•StepOne™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503ROX™,TexasRed®570~590nm~620•StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~62053荧光染料组合•ViiA™7实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®,SYTO®9(MeltDoctor™),Fluorescein,SYPRO®Orange455~485nm~520nm2VIC®,JOE™,TET™,HEX™510~530nm~550nm3NED™,BODIPY®TMR-X，TAMRA™540~550nm~580nm4ROX™,TexasRed®570~590nm~620nm5LIZ™630~650nm~680nm6AlexaFluor®,Joda-4650~670nm~710nm•7500实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™,Cy3，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~6105CY5Dye™630~650nm~65054SYBR®GreenI染料55SYBR®GreenI作用机理56SYBR®GreenI作用机理57SYBR®GreenI作用机理58实时记录每个循环后荧光信号的变化荧光循环数59任何双链，非特异结合不准确结果非特异产物信号SYBR®GreenI方法的局限性60通过熔解曲线检查产物特异性荧光温度•Tm值：DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。61单一PCR产物的熔解曲线荧光温度62多个PCR产物的熔解曲线非特异扩增引物二聚体63Questions?