双向电泳原理及实验步骤

蛋白质组双向电泳实验操作1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。蛋白质组分析的首要要求•将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。•2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定一、双向电泳的实验原理+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦一维固相pH梯度等电聚焦（IEFwithIPG）：•IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3-10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。–chargesize第二向：SDS-PAGE电泳Proteinsmigratethroughthegelatarateproportionaltotheirsize.Smallestproteinstravelthefurthestdistance+pH3pH7.5pH10样品制备基本原则•使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。•防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。•防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）。•完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。•尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。样品制备•细胞样品：反复冻融、超声破碎•组织样品：碾磨、匀浆•植物样品：碾磨•分泌蛋白蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白•菌体蛋白裂解液处理、超声破碎可溶性样品固体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。双向电泳样品的溶解•是成功进行双向电泳的最关键因素之一•溶解的目标：–样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；–必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；–保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。去垢剂：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。两性载体电解质：即便在离液剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。两性载体电解质的作用在于补充样品中少量的盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的升压困难、速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。样品上样缓冲液标准溶液：ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml胶条蛋白载样量影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：•待分析的蛋白点的量需满足随后的质谱分析。•电泳的研究目的。•待研究蛋白的丰度：•样品的复杂度。•IPG胶条的pH范围IPG胶条蛋白质大约载样量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100g/125l200~500ug/125l11cm50~200g/185l250~1000ug/185l17cm100~300g/300l1~3mg/300l蛋白质样品的上样量StripRange7cm11cm17cmBroadRange3-10,3-10Nonlinear1x1.6x2.4xNarrowRange3-6,5-8,7-10,4-72.3x3.7x5.7xMicroRange3.9-5.1,4.7-5.9,5.5-6.7,6.3-8.35.8x9.2x14.2xEnhancedResolutionforDetectionofLowAbundanceProteins等电聚焦中pH梯度的选择先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。ReadyStripIPGStrippHRanges345678910Non-linear3.9-5.14.7-5.95.5-6.76.3-8.3BroadRangeSeparationsToolstoseparateanentiresampleonasinglegelpH3-10–CompletelinearviewpH3-10NL–ImprovedseparationofcrowdedpH4-8zonepH3-10pH3-10NLMoreDatawithNarrowRangeIEFpH3-10pH7-10pH5-8pH3-6pH3-10pH3-6pH5-8pH7-10IPGEffectiveStrippHOverlappingLengthRangeGelArea24cm3-1056cm18cm3-1044cm17cm3-1040cm11cm3-1026cm7cm3-1016cm聚焦时间的优化•要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。•聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。•聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。•过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。IEF的基本条件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid两维间的平衡•等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。•但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。•建议方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。二维SDS-PAGE•同普通SDS-PAGE类似。•但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。SecondDimensionSDS-PAGEMultipleGelFormatsMiniCriterionPROTEAN1°:60gsample,20kV-hr2°:8.6x6.8cm,40min944spots1°:100gsample,50kV-hr2°:13.3x8.7cm,1hr1,287spots1°:150gsample,80kV-hr2°:18.3x19.3cm,5.5hr1,724spots聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测理想显色剂的7S•安全（safety）：•灵敏（sensitivity）：•简单（simplicity）：•特异性（specificity）：•快速（speed）：•稳定（stability）：•兼容性（synergy）：适用于质谱的染色方法•考马斯亮兰（Bio-Safe™Coomassie™colloidal250stain）•银染（SilverStainPlus™stain）•荧光染色（SYPRO®Rubyproteingelstain）考马斯亮蓝染色•考马斯亮蓝检测范围30-100ng，灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。•胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长（24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便。•Bio-Safe染料是一种改良的胶体金染色方法。安全无污染，染色非常快（2小时），完全与下游质谱兼容。银染•银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。•快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。•Bio-Rad有两种银染试剂盒：–普通银染试剂盒——质谱不兼容–增强型银染试剂盒——质谱兼容荧光染料•SYPRORuby染料–灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色–染色所需时间较短–染色的动态线性范围大大优于胶体金染色，扩展了约1000倍。–荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，不干扰质谱或免疫检测过程•Cy3和Cy5–两种染料可分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，在一块2-D胶上同步运行，可以很方便的找出差异–但因其需要对蛋白质进行共价修饰、改变了标记蛋白质的移动性能–由于荧光探针猝灭作用会引起快速衰减。蛋白与蛋白之间由于可被荧光团修饰的功能基团数目不同而使得灵敏度变化很大–荧光团的加入会降低蛋白质溶解性能。凝胶的图像处理分析典型流程•凝胶图像的扫描：•图像加工：•斑点检测和定量：•凝胶配比：•数据分析：•数据呈递和解释：•2-DE数据库的建立：综合的数据管理PDQuestImageDifferentialAnalysisSpotCuttingProteinDigestionMassSpecPMF/MS-MSGlobalDatabaseSearc