第三章 食用菌菌种制作

第三章食用菌菌种制作菌种的制作是食用菌栽培的前提和重要环节，菌种质量的好坏直接影响栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种才能获得高产和优质的产品，因此生产优良的菌种是食用菌栽培的一个极其重要的环节。菌种概述狭义是指经人工培养，并可供进一步繁殖或栽培使用的食用菌纯双核菌丝体。广义以保藏、试验、栽培和其它用途为目的，具繁衍能力，遗传特性相对稳定的孢子、组织或菌丝体及其营养性或非营养性的载体一、菌种的概念一级种二级种三级种来源、繁殖代数和使用目的按保藏种实验种生产种使用目的固体菌种液体菌种状态二、菌种类型（一）级别不同的菌种1.一级种（母种）用组织分离或孢子分离而得到的最初的菌种概念概况培养环境试管、斜面培养基用途再生母种扩大原种保藏用种菌丝弱而少、不可直接栽培特点2.二级种（原种）将母种扩大至粗放培养基上形成的菌种概念概况培养环境菌丝较多而壮、适应性较强特点用途扩大栽培种大口瓶、较粗放的液体或固体培养基3.三级种（栽培种）将原种扩大至粗放培养基上形成的菌种概念概况培养环境菌丝多而壮、适应性强特点用途栽培生产菌种袋、较粗放的液体或固体培养基生产总过程母种栽培种栽培原种子实体（二）状态不同的菌种用固体基质培养的菌种1.固体菌种概念特点设备、工艺简单菌龄长而不一发酵率较低用液体基质培养的菌种2.液体菌种概念特点设备、工艺较复杂菌龄短而一致发酵率高易老化和自溶三、菌种生产程序四大步骤制培养基灭菌培养接种第一节制种条件制种条件主要包括制种场地，仪器设备和消毒灭菌的药品。为了确保菌种的质量和数量，必须科学地选择和合理布局制种场地，具备必要的仪器设备、用具及消毒灭菌的药品等，才能制备出优质菌种。一、制种场地仓库配料室灭菌室接种室培养室办公室栽培棚门口晒料场二、主要生产设备一、制培养基设备二、灭菌设备三、接种设备四、培养设备五、保藏设备一、制培养基设备（一）原料处理设备切片粉碎两用机切片粉碎两用机铡草机粉碎机拌料机装袋机（二）培养基分装设备装瓶机挖瓶机菌种袋颈圈菌种瓶二、灭菌设备高压锅外锅：装水内锅：装物（有壁管）锅盖安全阀排气阀压力表常压密闭性好要求1.接种箱用法清洁、放物品→消毒喷雾熏蒸紫外灯特点简易、利移动对人体低害效果好、工效低三、接种设备（一）接种环境观察窗紫外灯操作孔2.接种室缓冲间：2~3m2接种间：5~6m2面积7~9m2高2.2~2.5m要求6个面平滑两门错开、平拉式顶装紫外灯清洁→物品放缓冲间→消毒→移物至接种间→喷消毒液→10min后接种→消毒液清洁使用使一定工作区达到相对无菌、无尘状态的电器3.超净工作台双人单人要求:前端为导热性好的金属材料枪匙钩铲镊耙针环接种4.接种工具固体菌种接种枪液体菌种接种枪返回本节四、菌种培养设备1.培养箱培养少量菌种的恒温电器（20~40℃）2.培养室培养大量菌种的恒温房要求光线暗密闭好、通风性强能升温、降温（空调机）有培养架贮藏室远离污染源低温（4~8℃）干燥、通风、遮光用前要严格消毒杀虫地面常撒石灰粉保藏原种、栽培种：五、菌种保藏设备保藏母种：冰箱（4℃）左右基本概念杀死一切微生物，包括芽孢。灭菌分为杀菌：菌体尚存溶菌：菌体消失消毒：只杀死病源菌，未伤及芽孢防腐：暂时抑制微生物生长除菌：用冲洗、过滤等机械的方法，除去微生物三、常用的消毒灭菌药品化学消毒杀菌剂广泛用于食用菌生产过程中的消毒灭菌，其主要种类有：1、重金属盐类：如汞、银、铝、锌、铜等。杀菌机理：是通过与蛋白质结合而引起蛋白质变性。低浓度的重金属对微生物起到抑制或杀死作用。微生物浸在0.1~0.5%硝酸银升汞溶液中，几分种就会死亡。常用0.1~0.2%升汞溶液对玻璃器皿、非金属器械及用于菌种分离的菌菇、菇木进行表面消毒。2、氧化剂：如高锰酸钾、过氧化氢、臭氧、漂白粉等。杀菌作用：通过强烈的氧化作用，破坏微生物的原生质或酶蛋白质结构。（一）、消毒杀菌剂3、还原剂：如甲醛，5%的甲醛可杀死细菌芽孢和真菌孢子。甲醛能与微生物细胞蛋白质的氨基酸结合，引起蛋白质变性。使原生质失去正常活动能力。4、表面活性剂：如乙醇，75%乙醇的消毒力最强，过高过低消毒效果都差。常用于接种前手指消毒及不耐热制品的消毒。5、其它消毒剂：石灰，以4份生石灰加入1份水，即生成熟石灰、并放出热，具有杀菌作用。硫磺，常用于培养室和出菇房等空间熏蒸杀菌。杀菌机理：硫磺粉燃烧后产生二氧化硫，二氧化硫与水作用生成亚硫酸，亚硫酸能夺取菌体细胞中的氧，菌体细胞因脱氧至死。（二）、表面消毒杀菌表面消毒常用于菌种的分离材料、接种人员的手、器材、工作台面、墙壁等的杀菌处理，表面消毒剂的种类很多，一般是通过涂抹、喷雾、浸泡、洗刷等方法使用。1、菌种分离材料的表面消毒：子实体未外露的，用0.1%升汞溶液浸泡1分钟；子实体已外露的种菇材料，只能用75%酒精棉球擦菌盖表面和菌柄，不能浸泡在升汞溶液中。2、手的表面消毒：先用肥皂洗手，再用1~2%来苏尔等溶液浸泡2分钟。接种前用之于75%酒精擦手。3、接种工具的消毒杀菌，先用75%酒精擦拭刀片、镊子、接种铲等工具，然后用酒精灯火焰燃烧。4、器皿的杀菌：利用高温空气进行干热灭菌，具体方法是：，生产中也常用高压蒸汽灭菌法对器皿进行灭菌。5、墙壁、台面、菇床的表面消毒：常用2~5%的漂白粉洗刷接种室、培养室墙壁、地面、床架、用具等。（三）、室内空间杀菌接种箱、培养室、出菇房的空间消毒主要采用紫外线杀菌和气体灭菌法，还可辅以空间喷雾的方法，增强杀菌的效果。1、紫外线杀菌法适用：一般应用于无菌室、接种箱、超净工作台内的灭菌。只适用于空气和物体表面的消毒。使用方法：一般照射20～30min，可杀死空气中95%的细菌。应该在黑暗中使用紫外线。杀菌机理：导致菌体细胞内核酸和酶发生光化学变化，而使细胞死亡；紫外线可使空气中的氧气产生臭氧，臭氧也具杀菌作用。2、气体灭菌法（熏蒸杀菌法）适用：接种箱、接种室和菇房消毒。常用药物：40%甲醛溶液、硫磺、菇保一号、科达气雾消毒盒、克霉灵气雾消毒剂。第二节母种制作一、母种培养基制作二、菌种分离三、母种扩繁（一）营养液制作(PDA培养基)1.准备工作（1）材料马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、水。（2）仪器用具及消毒药品电炉子、铝锅、玻璃棒、漏斗、纱布、止水夹、漏斗架、切菜小刀、切板、1000ml烧杯、捆扎绳、棉花、试管（18mm×180mm）、试管架、铁丝筐、1.5cm厚的长木条、标签、天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、牛皮纸、皮筋、纱布、恒温培养箱、手提式高压灭菌锅、超净工作台或接种箱、接种铲、酒精灯、火柴、记号笔等。消毒药品包括：75％的酒精棉球、0.25%新洁尔灭溶液、烟雾消毒王或菇保一号等。一母种培养基制作将学生分成几组，分别负责切土豆、称量水、称量药品、处理琼脂等。2.称量、材料预处理将切好的马铃薯块加适量水后放入铝锅或电饭锅中，煮至酥而不烂。3.熬制4.过滤、加可溶药物用双层纱布过滤，取滤汁，放在铝锅中加入糖。在沸腾状态下加入琼脂粉，直到琼脂完全溶化为止，定容至1000ml。5.加琼脂，定容（二）营养液分装1.用注射器或用带止水夹的漏斗分装2.分装量为试管长度的1/4—1/5。注意培养基不能沾污试管口。9或11支试管捆在一起，棉塞上包好防水纸，直立放入高压灭菌锅中。棉塞松紧适度，1/3在管外，2/3在管内。3.塞棉塞4.捆扎A正确B不正确在1.1kg/cm3压力下维持30--40min。（三）灭菌灭菌结束后锅盖开1/5的小缝，用余热烘干报纸和棉塞，然后摆斜面。斜面长是试管总长的1/2(四)摆斜面概念：菌种移至新培养基上的过程关键：无菌操作接种在严格消毒灭菌条件下进行的操作无菌操作概念要点接种环境消毒灭菌酒精棉球消毒双手开启的管口、瓶口靠近灯焰拔出的棉塞勿触及任何地方动作快，接种时间勿太长（一）概念菌种分离：用无菌操作的方法将所需要的食用菌从混杂的微生物群体中单独分离出来的过程。（二）关键严格按无菌操作规程进行无菌操作：任何一个操作过程都要注意避免把其它任何无关的菌体带入到培养基中。注意二点：1．严格树立无菌观念；2．严格遵循无菌操作规程。（三）方法食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法。二菌种分离（1）概念将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。（2）特点：①属于无性繁殖，能保持原有菌株的优良种性，是获得纯菌种的常用方法，且简单易行。③若种菇感染病毒，不易脱毒。1．组织分离法（无性繁殖）（3）根据切取的组织来源不同，组织分离可分为子实体组织分离、菌核菌索组织分离和机内菌丝分离三种方法。生产上最常用的是子实体组织分离。子实体组织分离：从食用菌的子实体上切取一块组织，通过分离培养而获得母种的方法。菌核菌索组织分离：在菌核菌索上切取一块组织，通过分离培养而获得母种的方法。机内菌丝组织分离：在培养基中直接挑取生长的菌丝，通过分离培养而获得母种的方法。取大型伞菌子实体菌柄与菌盖交界处或菌柄上部的菌肉，分离效果最好。金针菇是横切菌盖上薄的菌肉或取未开伞的幼嫩子实体的菌褶片灵芝组织分离所取的部位是菌盖边缘的白色生长圈木耳等胶质菌类的菌肉薄，子实体经无菌水反复冲洗后，撕开子实体或用刀片将两层耳片切开，挑取一小块菌肉组织即可。操作过程（以子实体组织分离为例）：种菇选择：选择头潮菇、外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常、尚未散孢、无病虫害、长至七八分成熟的优质单朵菇作种菇。种菇消毒：0.1%升汞溶液或75%酒精，浸泡或擦拭，无菌水冲洗，吸干表面的水分。切块接种：将分离种菇沿柄中心纵向掰成两半，用解剖刀在菇盖柄交接处划成田字形，取黄豆大一小块菌肉组织，接在斜面培养基上。培养纯化：在25℃下，培养2～4d长出白色绒毛状菌丝体，当菌丝延伸到基质上后，用接种针挑取菌丝顶端部分，接种到新的斜面培养基上，长满管后即为母种。2、孢子分离法孢子是食用菌的有性繁殖单位，能自动从成熟的子实体上弹射出来。孢子分离法是指在无菌条件下，使食用菌产生的孢子在适宜的培养基上萌发，长成菌丝体而获得纯菌种的方法。孢子分离分为单孢分离法和多孢分离法两种。单孢分离法：是在采集到大量孢子的基础上，经过稀释或使用单孢分离器等方法，使孢子之间互相分开，各个孢子单独萌发出菌丝而获得纯菌种的方法，常用于杂交育种和其它研究。多孢分离法：是将多个孢子接种在同一培养基上，使其萌发，自由交配而获得纯菌种的方法。孢子分离法的优点（1）有性孢子具有双亲的遗传特性，变异性大，是选育新菌株和杂交育种的好材料，可供选择优良菌株的机会较多。（2）孢子的生命力强，所得菌种生活力旺盛。因此，又常被用作菌种复壮的手段。分离到的菌株要通过出菇试验才能确定其是否好的菌种。步骤种菇消毒采收孢子接种孢子整菇插种法钩悬法在无菌条件下，可用75%的棉球对种菇进行表面消毒，或用0.1%的升汞溶液浸1-2分钟，再用无菌水冲洗三次，无菌纱布吸干表面水分。1.种菇的消毒2.采收孢子整菇插种法种菇插在孢子收集器中使孢子散落于培养皿内的方法用前灭菌25℃、24h现孢子粉取出分离材料培养皿盖严钩悬法25℃、24h现孢子粉取出分离材料放入接种箱用于孢子分离的平菇，经过8～12小时后就有孢子弹出，一般放１昼夜培养皿中就有厚厚一层白色孢子印，这时要及时进行接种。一朵菇体弹射的孢子量可接种10支以上试管种，接种完成后贴上标签放入25℃左右的恒温箱中培养。培养过程中，前3～4天为孢子定植期，外表看不出任何变化，7天以后孢子开始萌发并在四周长出白色绒毛状菌丝体，16～18天左右菌丝布满培养基面，即得纯菌丝母种，如有污染管应及时弃除。3.接种与培养多孢分离法斜面划线法在无菌条件下，用接种环从采集的孢子上蘸取少量孢子，在试管斜面上自下而上划线，待孢子萌发长出菌丝后自由结合，挑选长势好的转接，培养既得纯菌种。三、母种的转接母种转接，也称转管、母种的继代培养。由于分离或引进的原始母种数量有限，不能满足生产所需，因此，需进行扩大培养，通常原始母种允许扩大转接３~４次。母种的转管次数不宜过多，否则会降低菌种的生活力，影响栽培效果。不具备条件和