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通过生物制造法，生物质可以被转化为生物能源、大宗化学品和精细化合物，从而代替基于石油的化工制造。生物制造的核心技术是构建高效的微生物细胞工厂，从而将生物质原材料转化为各种终端产品。许多传统的欧美化工巨头，如Dupont、Cargill、BASF、Degussa已经逐步在从化工制造向生物制造方向转变。Dupont公司的生物制造已经占到其生产总值的20%。另一方面，近几年来许多中小型生物技术研究公司也迅速成立，如Genencor、Metabolix、Amyris、LS9、Myriant、MetabolicExplorer等。这些研究型公司通过构建高效微生物细胞工厂，开发出很多重要化合物的生物制造技术，如纤维素乙醇、乳酸、丁二酸、聚羟基脂肪酸酯（PHA）、各种氨基酸、1,3-丙二醇等。我们的学习相对于工业界在总体上应该有一定的超前性，学习国内外最前沿的东西，然后去比较，了解现实，发现问题，感觉未来，这样大家进入工业界之后才有推动技术进步的欲望和能力。研究基因功能的各种分子生物学技术学习目的：为进一步了解生物体内各种生理过程、提供了强有力的技术支持。在细胞内或外研究基因功能蛋白质之间的相互作用认识信号转导通路蛋白质翻译后修饰加工等6.1基因表达研究技术1、基因表达系列分析技术（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。锚定酶识别4个碱基。分离3’端酶解片段并将其分为两份，分别与连接子1和连接子2（均含有IIS类标签酶的识别位点）结合，用标签酶（一种Ⅱ类限制酶，它能在距离识别位点数个或十数个碱基的位置切割DNA双链）如BsmF1酶切，将含有连接子1和2的样品混合后测序分析。2、RNA的选择性剪接RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。包括：平衡剪接(a)、5’选择性剪接(b)、3’选择性剪接(c)、外显子遗漏型剪接(d)及相互排斥性剪接(e)。3、原位杂交技术原位杂交(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。图为人肌糖原磷酸酶基因在11号染色体的定位结果。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)9荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA荧光原位杂交显示的端粒荧光素标记探针DNA染色体DNA检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的互补序列在染色体或DNA上的位置134定点突变技术定点突变（site－directedmutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。14体外定点突变的具体方法有三种：（1）寡聚核苷酸介导的定点突变；（2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）；（3）大引物诱变法。以上三种方法虽不同，但原理都一致。151、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术已知序列的环状DNA人工合成一段引物变性模板定点突变细菌转化延伸诱变寡核苷酸引物DNA聚合酶筛选引入突变的环状DNA162、重叠延伸技术正向诱变引物FM反向引物R2正向引物F2反向诱变引物RM已知序列DNA模板在重叠区发生退火PCR3使用引物F2和R2扩增PCR4全长突变DNA片段形成全长双链突变DNA反向互补产物产物21PCR3、环状突变技术PCR介导的定点突变方法的优势•1.突变体回收率高•2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变•3.可在同一试管中完成所有反应•4.快速简便6.2基因敲除技术1、基本原理经典遗传学（Forwardgenetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reversegenetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。概念：基因敲除（geneknockout)又称基因打靶（genetargeting）。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有功能的基因缺失的技术称为基因敲除。基因打靶的必备条件•打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就是能接受外源基因的受体（常用的是胚胎干细胞）打靶载体（targetingvector）通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中。一个好的载体应具备以下特点：①能在宿主细胞中稳定存在；②具有一个以上的遗传标志，胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）•ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。•因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚胎移植入母鼠子宫内，使ES细胞有机会发育成小鼠或某种组织。•一般认为，基因的同源重组只发生在一条染色体上，当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换后，另一条染色体上的等位基因不再发生置换，因此，经同源重组后只能得到嵌合体小鼠（chimericmouse）。•然后经过杂交育种，按孟德尔遗传规律，其后代中有四分之一的几率为纯和子，这样经过将嵌合体小鼠和正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠，即基因敲除小鼠。25基因敲除完全基因敲除条件型基因敲除1、完全基因敲除完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。基本原理:构建与靶基因同源(10～15kb)的载体外显子插有新霉素抗性基因（neor）作为正选择的标志疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择体外培养新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选将重组体导入ES细胞存活的ES细胞27方法表型分析构建载体同源重组筛选X被敲除的ES细胞显微注射回交得到X被敲除的动物282、条件型基因敲除条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。常用的条件型基因敲除有：噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统构建打靶载体同源重组筛选中靶ES显微注射杂交删除neor基因特定阶段诱导Cre酶切除目的片段动物观察分析Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除的程序：体外培养基因敲除技术的应用1、研究基因调控和基因功能；2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学；4、治疗遗传病，即基因治疗。5、改造生物、培育新的生物品种。2.高等动物基因敲除技术显微注射方法真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。1酵母单杂交法酵母单杂交（yeastone－hybridsystem)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。6.3蛋白质及其RNA相互作用技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术37转录激活结构域（activationdomain，AD）DNA结合结构域（DNAbindingdomain，BD）基本原理：顺式作用元件报告基因得到表达激活Pmin启动子真核生物转录因子基本构件39应用领域：主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能编码基因；验证反式转录调控因子的DNA结合结构域；准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。402酵母双杂交系统酵母双杂交系统（Yeasttwo－hybridsystem）巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（DNAbindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。423、体外蛋白质相互作用技术（1）FarWestern印迹技术用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。（2）GST融合蛋白沉降技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。图6-27GST融合蛋白沉降技术流程。（3）蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。（4）等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。（5）免疫共沉淀技术(Co-IP)将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，加入可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。靶蛋白抗体固体基质待筛选蛋白低离心力沉淀或微膜过滤亲和反应反应体系靶蛋白抗体待筛选蛋白相互作用沉淀得到待筛选蛋白图6-22免疫共沉淀示意图染色质免疫共沉淀ChIP:Chromatinimmunoprecipitation主要实验流程：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。定性或定量检测体内转录因子与DNA的动态作用。•5、RNAi（RNAinterference,RNA干涉）技术及其应用–RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。