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氯仿蒸蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷一、采样与样品预处理(同微生物生物量碳)士穰样品的采集方法和要求与现IJ定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和l可见的土壤动物(如蜓蚓[)等，然后迅速过筛(2~3皿).或放在低温下(2~4C)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动士壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的士壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养l周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和I稀NaOH.以保持其湿度和1吸收释放的CO，。预培养后的士壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2~4'C)最好不要超过10d。二、方法一氯仿蒸蒸浸提法CFE)1、方法原理土壤经氯仿蕉蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到士壤中，导致土壤中的可提取的磷大幅度增加。通过测定浸提液中磷的增加量，估算土壤微生物量磷。浸提液中磷用铝锦抗比色法测定。2、仪器及设备培养箱;真空干燥器;真空泵:往复式振荡机(速率200rev/min);冰柜;分光光度计3、试剂l无乙醇氯仿:量取500mL氯仿于1000mL的分液漏斗中，加入5日mL硫酸溶液[甲(H，SO.)=5%].充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无7](K，CO，.在冰箱的冷藏室中保存备用。(试剂浓硫酸。他SO.)=9Ç98%•稀释19倍)2.O.5mol/LNaHCO42.0gNaHCO，(化学纯)溶于800mL水中，用O.5mol/LNaOH调节溶液的pH至8.5.用去离子水稀释至lL。溶液贮存于塑料瓶中。长时间放置，使用前必须检验pH值。3细锦抗试剂·称取酒石酸饼饵O.5g.溶解于100mL水中，制成0.5%的溶液。另称取锢酸饺10g.溶于450mL水中，徐徐加入153mL浓比S04.边加边搅。再将O.5%的酒石酸锈钢溶液加入到锢酸锁溶液中，最后加水至11.充分Jlìi匀，贮存于棕色瓶中。临用前(当天).称取左旋抗坏血酸1.5克(Vc.三级).溶解于10伽止锢锦贮各液中，此溶液有效期为24h。4磷标准溶液准确称取在105'C烘箱中烘干的阻，PO.(分析纯)0.4394g.溶解在400mL水中，加浓fbSO.5mL(防止发霉).转入lL容量瓶中，定容，摇匀。此溶液为100mg/LP标准溶液，在4'C冰箱中可长期贮存。吸取磷标准溶液5mL.稀释至100mL.即为5mg/LP标准溶液(不宜久存)。5.250ug/mL阳，POO.5492gKf!，PO.定容至500ml水O.10984g定容至100ml。6硫酸溶液(2.5molL']):量取70.0m!分析纯浓硫酸，稀释至500m!。7.lmolL']NaOH:称取40g分析纯氢氧化纳，溶于lL蒸馆水中。8.2，6二硝基盼指示剂:称取0.2g指示剂溶于100m!水中。4、操作步骤4.1蕉蒸称取相当于5.0g烘干土重的湿润士壤3份，分别放在约100mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有50mLNaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为O.5皿的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵拙气至氯仿沸腾并保持至少2mino关闭干燥器的阀门，在2旷C的黑暗条件下放置24h。打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行蒸蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和l氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。蕉蒸开始的同时，称取等量士攘3份，用NaHCO，溶液(见下一步骤，试剂2)浸提，同时做不加士壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周，1'C下放置1个月或在15'C下保存。4.2浸提蒸蒸结束后，将土壤全部转移到250mL的震荡瓶中，加入80mLO.5mol/LNaHCo，溶液，在振荡机上振荡浸提30min(25'C,185rev/min)，用无磷滤纸过滤。蒸蒸开始的同时，称取等量土壤3份，同上用0.5mol/LNaHCO,80mL溶液浸提，同时做不加土壤为空臼对照。浸提液立即测定或在-15'C下保存。F回收率测定另取等量士壤3份，加入O.5mL250ug/mLK比PO.c50ugP/g士)，同上加入80mLO.5mol/LNaHCO，溶液浸提，浸提液在室温下可以放置l周，4'C下放置1个月或在15'C下保存。4.3测定吸取士壤浸提液25mL(根据土壤含磷量进行调整)于50mL容量瓶中调解pH:加2，6-二硝基苯盼1-2滴，用3mol/L的硫酸把溶液调至无色。回滴用lmol/L5、结果计算l熏蒸和l未熏蒸浸提的磷量Cmg/kg)P(mg/kg)显色液PCmg/kg)X显色液体积Xts/DW式中:显色液P(1昭/kg)一一标准曲线中查得显色液的P(mg/kg)数:显色液体积一-50mL;ts分取倍数(浸提液总体积/吸取浸提液体积)DW土壤的烘干质量，g。2.生物量磷CBp)的计算Bp=(F-UF)/(KpXR)n.co门1式中·非一一熏蒸浸提的磷量(mg/kg);UF一一未熏蒸浸捷的磷量Cmg/kg);Kp一一夜提液微生物生物量磷占总微生物生物量磷的比例，为0.4;R(%)加入无机磷的回收率。R(%)=[(测定值土壤可溶性无机磷)/25)X10日%测定值一一土壤加入KJlPO.溶液后，再浸提所得到的磷Cmg/kg);士:IU可溶性无机磷一一未熏蒸浸提的磷量(mg/kg);2弘一一浸提前加入的磷量Cmg/kg)。(与林启美老师word文档内容一致)