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-1-药药药物物物筛筛筛选选选完完完全全全解解解决决决方方方案案案Whereverresearchersarelookingfornewdrugs,youwillfindMolecularDevices3临床研究快速索引药物筛选简介………………………..3药物筛选流程………………………4药物筛选主要靶点…………………..4GPCR药物筛选………………….....5激酶药物筛选……………………….12离子通道药物筛选…………………..18膜转运体……………………………..25MD技术平台………………………..28药物筛选简介药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性化合物的过程。是临床新药开发的必经过程。一个新药的从研发到临床使用历时十年以上，耗资10亿美金。平均而言，每一百万个化合物中昀终能被FDA批准上市的只有一个，而上市的药物中，也只有30%的药物能够获得的利润，收回其研发成本。制药公司年收入的20%用在新药的研发上，全球每年在新药上的投资超过300亿美金。在先导化合物的后续筛选过程中，40%到60%的先导化合物在后续的ADME/T（药物吸收、分布、代谢、分泌和毒性检测）中被淘汰。72%的药物研发费用被浪费在：日益增长的临床耗费、体内无法预测的调控环境以及药物的副作用方面。因此，选出优良品质的先导化合物是药物筛选的一个至关重要的过程。各制药公司在药物开发的早期都会收集尽可能多的关于靶点、待测化合物性质、以及现有筛选方法手段优劣性的信息，以确保尽快剔出阴性化合物，拿到优良品质的先导化合物，降低药物筛选的成本。MD公司一直致力于新产品的开发和革新，为四类主要靶点的药物筛选提供了从仪器到试剂的完整地解决方案，为优良先导化合物的筛选提供了有力保障。-4-药物筛选流程：药物筛选的主要靶点FDA批准的前十大类药物分类示意图13.4%将这些靶点归类，GPCR受体离子通道膜转运体激酶四个靶点占靶点总量的70%以上，组成目前药筛领域的四大主要靶点。16临床前期：实验动物试验筛选过程（2-10年）筛选不同阶段的获得成功的化合物总量10,000临床一期：20-40健康志愿者测试，确定安全性和剂临床二期：100-300名病人志愿者测试，观察药物效应和副作用。临床三期：3000-5000名病人志愿者，用于观测长期使用的不良效应。FDA检测/批准其他的上市后检测02468101214Year25010MMDD系系统统1鉴定先导化合物-5-GPCR筛选方案GPCR药物筛选简介GPCR受体超家族总共有600-1000种蛋白，是目前已知的具有治疗前景的昀大的一类分子作用靶蛋白。目前的药物筛选中有40%是针对GPCRs的筛选，且市售的药物中有超过50%的药物是通过GPCR发挥药效的。GPCR已经成为药物筛选的第一大类靶点。GPCR即与G蛋白偶联受体，G蛋白（GTP结合蛋白）包含三个亚基：Gα、β和γ，形成三聚体。当细胞外配体与GPCR结合，GPCR构象改变，激活G蛋白，GTP磷酸化Gα亚基，Gα亚基从三聚体解离，与β和γ亚基分离。Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器AC（磷脂酶C）和PLC（腺苷酰环化酶）并产生生物学效应。βγ亚基也能够激活其他通路，如通过磷脂酶A2激活心肌细胞K+通道等，产生生物学效应。但通常所讲的G蛋白一般是指α亚基。Gα的不同亚型Gαs、Gαi和Gαq激活后会产生不同的生物学效应，其中Gas-偶联受体激活腺苷酰环化酶(AC)导致cAMP增加；Gai-偶联受体激活腺苷酰环化酶(AC)导致cAMP降低；Gaq偶联受体激活磷脂酶C(PLC)，产生IP3，IP3能使细胞内Ca2+增加（见上图）。由于Gαs、Gαi和Gαq激活后会产生不同的生物产物，因此通过Gα的不同亚型Gαs、Gαi和Gαq激活后会产生的生物学产物的检测，可达到筛选GPCRs的目的。目前是市场上对GPCRs的筛选方法众多，包括同位素标记法、荧光标记法、抗体标记法等等。通过不懈的努力，MolecularDevices也为GPCRs为靶点的药物筛选做出了独有的贡献。MolecularDevices为GPCR提供的解决方案●通过Gq通路检测的方法：-6-1，细胞内钙离子浓度变化荧光检测法GPCR信号通过Gq会使细胞内钙释放，因此通过钙离子敏感荧光探针检测细胞内钙释放，即可检测通过Gq途径信号转导的GPCRs。MD公司的FlexStation3、FLIPR能够配合使用高效高信噪比钙试剂盒：Calcium3、Calcium4和Calcium5AssayKit，FLIPR以每小时获取3万个以上的数据点的通量实现GPCRs的高通量筛选。试剂盒的原理如下：该试剂盒内包含钙离子敏感的荧光指示剂和Maskdye。在细胞外溶液中，荧光指示剂的荧光信号被Maskdye所掩盖。在细胞孵育过程中，细胞膜上的酯酶切除指示剂分子的AM部分，从而使该分子不能再反向通过细胞膜回到细胞外溶液中。Maskdye不能通过细胞膜，留在细胞外液中掩盖背景荧光信号。当细胞内钙离子浓度变化时，钙敏感指示剂的荧光信号也将会发生变化。应用实例：使用Calcium4Kit试剂盒，在内源性表达M1受体的CHO细胞上测定激动剂Carbachol诱导的钙离子浓度变化。BackgroundissignificantlyreducedbymaskingtheextracellularIncreaseincytosolicCa2+canbedetectedbyFLIPRusingcalciumsensitivedyeCa++ActiveGqCa++R-LComplexIntracellularmediatorsCa++Agonist/AntagonistCa++-7-以上为软件界面截屏图。运用ScreenWorks™系统软件可实现从数据获取到完成统计分析一体化。2，HTRFIP1检测法HTRF是CisBio公司的一检测平台，TR-FRET法是利用荧光素供体和受体之间的能量转移现象实现对分子结合状态的检测手段。HTRF是一种使用抗体的检测方法，因此检测方法更加灵活。GPCR的Gq激活后会诱导产生PLC，PLC的代谢产物为IP1，通过HTRF的方法，使游离IP1与标记IP1竞争性结合于抗体，能够阻断FRET过程，从而检测IP1分子，并实现GPCRs的筛选。具有HTRF功能的酶标仪SpectraMaxM5e和FlexStation3能够实现IP1分子的快速高通量检测。CHO-M1cell-basedassayEC50=0.64uMZ’=0.91IP1standardcurveEC50=358nMZ’=0.84-8-BottomReadTopRead左图是使用SpectraMaxM5和SoftMaxPro所作的Camp的校正曲线●通过Gi和Gs进行信号通路检测的方法：1，通过LiveWareCellLines检测细胞内钙离子浓度变化超过60%GPCRs是通过Gi和Gs诱导下游信号通路来发挥其生物学作用，Gi和Gs通过cAMP发挥作用，不会使细胞内的钙离子发生变化。为解决这一问题，MolecularDevices推出LiveWare细胞系。LiveWare细胞白表达G蛋白嵌合体。这种嵌合体包含Gq蛋白复合体的α亚基，其5碳末端氨基酸被替换为其他G蛋白（如Gαs，Gαi，Gαo，或Gαz）的碳末端，这些氨基酸负责将受体与其G蛋白耦合。因此，这类嵌合体即能在GPCR与配体结合时激活，也能诱导下游的细胞内钙离子释放，引起细胞内钙离子浓度变化。将这些具有特定非Gq嵌合体与相应的GPCR受体共表达，会使这些受体被激活后产生细胞内钙离子变化的效应。这样即可实现对无法造成细胞内钙离子变化的GPCRs的筛选。通过LiveWare细胞配合FLIPR高通量筛选设备和高效高信噪比Calcium试剂盒，以每小时获取3万个以上的数据点的通量实现GPCRs的高通量筛选。FlexStation3实现GPCRs的中、低通量筛选。2，CatchPoint®cAMP检测法GPCRs信号通过Gi或Gs会导致细胞内cAMP水平的上升或下降，检测cAMP的水平也能够实现对GPCRs的筛选。MolecularDevices推出的CatchPoint®cAMP试剂盒是一款专门检测细胞裂解液cAMP水平的试剂盒试剂盒内包含被荧光HRP标记的cAMP标准品。当细胞裂解液中cAMP增加，会会竟争性降低标准的连接HRP的cAMP和抗体结合得几率（如下图），从而使荧光信号减弱，达到检测cAMP的目的。实验结果可用具荧光功能的酶标仪，如SpectraMaxM5来检测。原理如下：-9-●通过Gq,Gi,和Gs进行信号通路检测的方法：MolecularDevices也推出一些独特的解决方法，适用于筛选所有GPCRs。1，CellKey®检测法当GPCR激活，Gq,Gi,和Gs会使细胞内钙离子浓度和cAMP水平发生改变，这些变化都会使细胞内肌动蛋白聚合、张力纤维形成，而使单层细胞的电阻值发生变化。CellKey®系统能够检测单层细胞结合刺激物或配体造成的细胞阻抗的变化，因此能够间接检测GPCR的活性。原理如下：应用实例：2，通过形态学对所有类型GPCRs进行筛选MolecularDevices推出独有的Transfluor检测法Transfluor平台是通过形态学特征，使用高内涵筛选（HCS）的方法能够检测所有类型GPCRs活性的方法。该法基于在GPCR内化和脱敏过程中β-Arrestin-GFP分布变化来检测GPCR活性。该检测法不依赖于信号转导通路和GPCR的类型（Gi,Go,Gs,Gq），能够检测包含检测困难的GPCR类型MuscarinicM1(transfected,Gq)Serotonin5HT1B(endogenous,Gi)ProstanoidEP4(endogenous,Gs)Cellkey-10-对照受刺激后形成Pits受刺激后形成Vesicles在内的几乎所有GPCRs，包括孤儿受体。原理如图所示。细胞稳定表达GFP标记的蛋白β-Arrestin。当GPCR受体与配体结合后，会启动受体的脱敏过程。GRK使GPCR受体磷酸化，β-Arrestin进而与磷酸化了的GPCR受体相结合，促使受体内化，聚集，，在细胞内形成荧光斑点和颗粒。这些形态学的变化可用荧光显微镜或高内涵系统观察分析。MD的高内涵筛选系统ImageXpress系列产品能够通过检测GPCR脱敏和循环形成的GPCR受体斑点和囊泡，实现高通量的进行GPCR药物的筛选,为GPCR提供全套解决方案。应用实例斑点形成量效曲线囊泡形成量效曲线当GPCR激活时，β-抑制蛋白从胞浆转移到细胞膜，结合受体并使其内陷形成斑点和内体小泡。分别将异丙肾上腺素和普萘洛尔进行倍比稀释（浓度如表），并将其加入斑点和小泡形成细胞（普萘洛尔组在加入10uL175nM的异丙肾上腺素进行刺激后加入），将细胞固定后用DAPI进行细胞核染色，用ImageXpress进行20X成像扫描并使用AcuityXpress注释多孔板内的复合物和浓度，进行曲线拟合获得EC50和IC50。-11-综上所述，对于每一类型的GPCRs,MolecularDevices都推出了自己独有的解决方案，包括仪器和试剂。这些解决方案都深受广大客户的欢迎，部分方法被认为是这一领域的革新技术。总结如下：GPCR筛选解决方案：-12-IMAP®TechnologyIMAPReagentKits激酶筛选方案激酶药物筛选简介十年前当人类基因组刚刚发布的时候，在成千上万的蛋白库中理论预测可能为激酶的蛋白大概500种以上。在已公认的药物靶点中，蛋白激酶已成为药物发现领域中第二大类药物筛选靶点。激酶包括蛋白激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶。蛋白激酶是通过共价调节的方式将磷酸基团转移到其他蛋白上发挥功能的，它们是激酶药筛靶点分子中的昀大一类。蛋白激酶表达和功能失调会导致癌症和其他疾病。蛋白磷酸酶和磷酸二