化妆品中10种α-羟基酸检测方法征求意见稿

1化妆品中10种α-羟基酸检测方法（征求意见稿）高效液相色谱法1范围本方法规定了高效液相色谱法测定化妆品中α-羟基酸的含量。本方法适用于水剂、膏霜乳液化妆品中α-羟基酸含量的测定。本方法所指的α-羟基酸包括葡糖醛酸、酒石酸、羟基乙酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、2-羟基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸和羟基辛酸。2方法提要以水提取化妆品中葡糖醛酸等10种α-羟基酸组分，用高效液相色谱仪进行分析，以保留时间和紫外光谱图定性，峰面积定量。本方法中各种α-羟基酸的检出限、定量下限及取样量为1g时检出浓度和最低定量浓度见表1。表1各α-羟基酸的检出限、定量下限和检出浓度、最低定量浓度α-羟基酸组分检出限（μg）定量下限（μg）检出浓度（μg/g）最低定量浓度（μg/g）葡糖醛酸0.080.24150450酒石酸0.030.0960180羟基乙酸0.020.0640120苹果酸0.020.0640120乳酸0.050.15100300柠檬酸0.020.06401202-羟基丁酸0.040.1280240扁桃酸0.0010.00326二苯乙醇酸0.0010.00313羟基辛酸0.020.06401203试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。23.1磷酸氢二铵，分析纯。3.2磷酸，优级纯。3.3甲醇，色谱纯。3.4混合标准储备溶液：分别精密称取（精确到0.0001g）葡糖醛酸400mg、酒石酸200mg、羟基乙酸400mg、苹果酸400mg、乳酸500mg、柠檬酸400mg、2-羟基丁酸500mg、扁桃酸10mg、二苯乙醇酸10mg和羟基辛酸400mg于同一50mL容量瓶中，加水40mL，60℃超声15min使溶解，用水定容，配成如表2所示浓度的混合标准储备溶液。4仪器和设备4.1高效液相色谱仪，二极管阵列检测器。4.2天平。4.3超声波清洗器。4.4水浴锅。4.5高速离心机。4.6pH计。4.7涡旋振荡器。5分析步骤5.1混合标准系列溶液的制备分别精密移取不同体积的混合标准储备溶液（3.4）于10mL容量瓶中，用水定容，配制成浓度如表2所示的混合标准系列溶液。表2各α-羟基酸的储备溶液浓度及标准系列浓度α-羟基酸组分葡糖醛酸酒石酸羟基乙酸苹果酸乳酸柠檬酸2-羟基丁酸扁桃酸二苯乙醇酸羟基辛酸混合标准储备溶液，g/L8.04.08.08.010.08.010.00.20.28.0混合标准系列溶液，mg/L100501001001251001252.52.5100200100200200250200250552004002004004005004005001010400800400800800100080010002020800200010002000200025002000250050502000400020004000400050004000500010010040005.2样品处理称取样品1g（精确到0.001g）于10mL具塞比色管中，置于90℃水浴中30min以去除挥发性有机溶剂，加水至10mL，充分涡旋混合30s，60℃超声提取30min，取适量样品在10000rpm3下高速离心15min，取上清液过0.45μm的滤膜后作为待测溶液。5.3参考色谱条件色谱柱：CAPCELLPAKADMEC18柱（250mm×4.6mm×5μm），或等效色谱柱；当样品基质对待测α-羟基酸有干扰时，可采用CAPCELLPAKADMEC18柱（250mm×4.6mm×3μm）按表3流动相相同梯度洗脱程序进行分离；流动相：A：0.1mol/L的磷酸氢二铵溶液，用磷酸调pH值为3.0；B：甲醇；检测波长：214nm；柱温：室温；进样量：5μL。流动相梯度洗脱程序见表3：表3流动相梯度洗脱程序时间/min流速/mL/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%00.7100070.710007.11.01000141.0505014.11.03565231.0356523.10.71000280.710005.4测定在“5.3”色谱条件下，取α-羟基酸的混合标准系列溶液（5.1）分别进样，进行色谱分析，以标准系列溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。取“5.2”项下的待测溶液进样，根据保留时间和紫外光谱图定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中α-羟基酸的浓度。按“6”计算样品中α-羟基酸的含量。6分析结果的表述式中：ω——样品中α-羟基酸组分的质量分数，μg/g；ρ——从标准曲线得到待测组分的质量浓度，μg/mL；V——样品定容体积，mL；m——样品取样量，g。47图谱图1标准液相色谱图CAPCELLPAKADMEC18柱（250mm×4.6mm×5μm）1:葡糖醛酸（4.268min）；2:酒石酸（4.733min）；3:羟基乙酸（5.223min）；4:苹果酸（6.279min）；5:乳酸（7.636min）；6:柠檬酸（8.346min）；7:2-羟基丁酸（13.104min）；8:扁桃酸（17.157min）；9:二苯乙醇酸（20.677min）10:羟基辛酸（21.264min）。图2标准液相色谱图CAPCELLPAKADMEC18柱（250mm×4.6mm×3μm）1:葡糖醛酸（4.176min）；2:酒石酸（4.710min）；3:羟基乙酸（5.285min）；4:苹果酸（6.611min）；5:乳酸（8.260min）；6:柠檬酸（9.187min）；7:2-羟基丁酸（13.921min）；8:扁桃酸（17.636min）；9:二苯乙醇酸（21.613min）10:羟基辛酸（22.480min）。5附录A羟基乙酸等10种α-羟基酸结果的确证因α-羟基酸紫外吸收光谱图不特征，必要时可采用液相色谱－质谱法确证结果，以检查化妆品中是否有其他组分干扰α-羟基酸的测定。葡糖酸会干扰酒石酸的测定，乳糖酸会干扰葡糖醛酸的测定。在相同的液相色谱－质谱实验条件下，如果样品中色谱峰的保留时间和紫外光谱图与标准溶液中对应成分一致，所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的差不超过表1规定范围，则可以判定样品中存在对应的测定成分。表1结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%≥k20%20%≥k10%k≤10%允许的最大偏差±20%±25%±30%±50%A.1仪器参考条件A.1.1色谱条件色谱柱：CAPCELLPAKADMEC18柱（150mm×2.1mm×3μm），或等效色谱柱；流动相：A：乙腈（含0.1％甲酸）；B：0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序见表2：表2流动相梯度洗脱程序时间/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%0010040100159551795517.10100220100流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；A.1.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI源）；6监测模式：负离子多反应监测模式；监测离子对及相关电压参数设定见表3；雾化气流速：3L/min；干燥气流速：15L/min；脱溶剂管温度：300℃；离子源加热温度：500℃；碰撞气：Ar，230kPa；离子源电压（IS）电压：4000V。表310种组分的监测离子对及相关电压参数设定表序号组分名称母离子（m/z）子离子（m/z）Q1CE(V)Q31葡糖醛酸193.20113.10191421131.101911222酒石酸149.1087.1015143073.001518263羟基乙酸75.2045.1020161347.102015134苹果酸133.20115.0012162071.201217255乳酸89.2043.1017131445.101715156柠檬酸191.10111.1018121987.1012111272-羟基丁酸103.2045.1018161657.101713198扁桃酸151.2075.10169269二苯乙醇酸227.10183.301491010羟基辛酸159.20113.2016161945.001617147A.2图谱图1混合标准溶液LC-MS色谱图1:葡糖醛酸（2.072min）；2:酒石酸（2.443min）；3:羟基乙酸（2.570min）；4:苹果酸（3.241min）；5:乳酸（3.956min）；6:柠檬酸（5.135min）；7:2-羟基丁酸（9.231min）；8:扁桃酸（2.570min）；9:二苯乙醇酸（13.594min）10:羟基辛酸（12.736min）。8化妆品中10种α-羟基酸检测方法起草说明为加强化妆品中限用物质的监督管理，进一步提高化妆品产品安全性，国家食品药品监督管理总局化妆品标准专家委员会秘书处组织开展了化妆品中10种α-羟基酸含量测定方法的起草工作。现就起草工作有关情况说明如下：一、起草的必要性α-羟基酸在化妆品中已有较长的使用历史，已成为护肤化妆品中较有效的、能促进皮肤再生的活性添加剂，可作为温和的剥离剂，也可用作pH调节剂和皮肤调理剂。α-羟基酸广泛用于洁肤、护肤和面膜产品上，有化妆水、乳液、膏霜和凝胶等多种剂型。α-羟基酸是生理学方面的胶粘剂，可使表皮细胞内聚力增加而呈光滑，短时间内皮肤组织有明显改善。由于α-羟基酸在抗皮肤老化方面的显著功效，它已成为“抗皮肤老化用品中最有效、最热门也是最为简单的成分”。但长期使用可能会减弱皮肤对紫外线的抵抗力，导致皮肤老化，加速细胞的破坏或死亡，导致皮肤发红、起泡及灼伤，可能给皮肤造成永久性的伤害，其长期的安全性无法得到保障。最近由化妆品、卫生品和香料协会发起的一项报告说，α羟基酸会增加对紫外线的敏感性。我国《化妆品安全技术规范》规定化妆品配方中其含量不得大于6%。因此，对α-羟基酸的检测是化妆品卫生管理的一项重要指标。二、起草依据及主要参考文献《化妆品安全技术规范》（2015年版）对5种α-羟基酸的测定选用液相色谱法（一法）、离子色谱法（二法）、气相色谱法（三法）共三种分析方法。此外，α-羟基酸的测定还有比色法、毛细管电泳法、化学发光法、核磁共振等分析方法。比色法虽操作简便、快速，但重复性较差，专一性不强，不适合多种α-羟基酸的同时分析测定。离子色谱法（IC）的前处理简单，检测限低，检测速度快，准确性高，干扰小，但需要专门的仪器配合使用，如分离柱、电导检测器等。IC法中五种物质保留时间比较接近，分离度差，容易引起相互干扰，是其方法的一大不足。由于α-羟基酸的热不稳定性和化学活泼性，α-羟基酸不能直接进行气相色谱分析，须经过硅烷化衍生后再进行分析，但是衍生化处理会使分析结果的重现性较差，而且比较费时，简便性方面要逊于其他方法。优点是抗干扰能力强，当样品中存在基体干扰时优于HPLC、IC法。液相色谱法检出限低，线性范围宽，准确度好，HPLC法通过保留时9间和光谱图进行定性，其定性能力优于IC、GC（仅通过保留时间定性）。液相色谱应用较离子色谱仪广泛，适用于包括水溶性和油溶性的各种样品检测，羟基酸紫外吸收强，适宜用液相色谱法进行测定。因此，综合比较各检测方法后选择液相色谱法对10种α-羟基酸进行定性定量分析并辅以液相色谱质谱法进行结果确证。本方法起草过程中的依据和参考文献资料如下：（一）化妆品安全技术规范（2015版）。（二）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范。（三）孙文闪，田富饶，王旭强，郑瀚.高效液相色谱法测定化妆品中5种α羟基酸，香料香精化妆品，2012年10月第5期，25-28（四）何乔桑，鹿燕.高效液相色谱法分析化妆品中的6种有机酸，化工时刊，Vol.26，No.1，30-34（五）张泓,王斌,周世伟.气相色谱法测定化妆品中的α-羟基酸,上海预防医学杂志，Vol.14,No.6，261-262三、起草原则本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前一般检测实验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的精确性和重现性。四、重点说明的问题（一）关于体例。本检