外植体

第四章外植体第一节外植体的选择第二节外植体的消毒第三节污染原因和预防措施第四节外植体的接种第五节外植体的褐变及其预防措施第一节外植体的选择一、外植体的种类二、外植体的来源三、取材季节四、外植体的的大小五、外植体的生理状态和发育年龄一、外植体的种类无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。基因型草本＞木本双子叶植物＞单子叶植物二、外植体的来源1、生长健壮在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。原因：代谢旺盛再生能力强（比较容易培养成功）。2、不同部位：靠近植株的近基部比较易成功。三、取材季节•组织培养选择材料时要注意:•植物的生长季节（生长最适季节）•植物的生长发育阶段。•如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；•花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。四、选取适宜的大小•建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。•材料太大:易污染，也不需要；•材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。•一般选取培养材料的大小，在0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。四、选取适宜的大小•茎尖分生组织：1-2个叶原基，0.2-0.3mm•叶片、花瓣：5mm2•茎段：0.5cm五、外植体的生理状态和发育年龄沿植物主轴越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，生理年龄越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官，反之相反。第二节外植体的消毒一、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效果次氯酸钠9—10易5—30很好次氯酸钙2易5—30很好漂白粉饱和浓度易5—30很好氯化汞0.1—1较难2—10最好酒精70—75易0.2—2好过氧化氢10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸银1较难5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60较好二、外植体的灭菌方法外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。常规的表面灭菌处理方法①把材料放进70%的酒精中约30s。②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡10min。或用10%的漂白粉上清液中浸10min～15min。③无菌蒸馏水冲洗3～5次。④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。第三节污染原因和预防措施一、污染的原因污染：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因：从病源菌方面来分析主要有：细菌真菌从污染的途径而言主要是：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等。原因：材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1-2天即可发现。原因：周围环境不清洁超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大等为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3-10天才能发现。二、污染的预防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施。1．防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水抽枝以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污染。•或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。（2）选择合适的时间去田间采取外植体避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。2．外植体的灭菌（1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先：除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在），同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；其次：将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌30min；2．外植体的灭菌第三：在无菌蒸馏水中冲洗3次；第四：将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第五：次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后，用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一周还应增加1次灭菌处理。（2）多种药液交替浸泡法对容易污染而难灭菌的材料：首先:取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；第二:将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟；第三:在1：500RoccalB（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min（2）多种药液交替浸泡法对容易污染而难灭菌的材料：第四：放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌5—10min；第五：用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。3．玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。4.金属器械的灭菌火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘米2（即15磅/英寸2），121C的温度，灭菌20min～30min。5．布质制品的灭菌6．无菌操作室的灭菌无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。7．操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行小结第一节外植体的选择：优良种质、健壮植株、最适的时期、适宜的大小。第二节外植体的消毒：9种常用灭菌药剂的使用及其效果、外植体的灭菌方法。第三节污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。外植体的接种：是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污染主要由：空气中的细菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。第四节外植体的接种1．操作人员操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果,进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。2．操作期间操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。2．操作期间在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。4．工具用后及时消毒工具用后及时消毒，避免交叉污染。工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。5．空气中有灰尘•由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。第五节外植体的褐变及其预防措施一、褐变概念二、褐变的原因三、影响褐变的因素四、褐变的预防措施一、褐变概念褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，二、褐变的原因离体植物一旦离体很容易褐变原因是：氧化蛋白质氨基酸胶链酚醌(褐色物质)衰老死亡。（植物体的一种防卫作用，有杀伤病菌作用，同时也限制细胞的分裂与生长）醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不，最终衰老死亡。三、影响褐变的因素1．植物材料2．培养条件3．培养基1．植物材料随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。（1）基因型（2）材料年龄（3）取材部位（4）取材时期（5）外植体大小及受伤害程度（1）基因型不同种植物同种植物不同类型不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变。原因：木本植物（木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，（2）材料年龄幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。平吉成从小金海棠、八楞海棠和山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。部位：顶芽、侧芽（Yu和Meredith在葡萄上从侧生蔓切取茎尖进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活。而苹果则顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。分生部位接种后醌类物质形成少；分化部位接种后醌类物质形成多。（3）取材部位（4）取材时期取材时期多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的。春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。Chever报道，欧洲栗在1月15日-30日醌类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明显提高。（5）外植体大小及受伤害程度金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重当茎尖长度在5mm-15mm时褐变较轻,成活率可达85%。在苹果品种上试验结果表明，用5mm-10mm长的茎尖进行培养效果最好茎尖如果太小很容易发生褐变。取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。外植体切口：太大易褐变，尽量小2．培养条件光照与温度温度过高光照过强均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。3．培养基（1）培养基状态（2）无机盐（3）植物生长调节物质（4）抗氧化剂（5