高通量药物筛选技

高通量药物筛选技术运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选。分子生物学细胞生物学基因组学蛋白组学生物信息学结构生物学计算机辅助药物设计药物化学高通量筛选技术天然产物化学合成组合化学化合物库筛选模型结构优化先导化合物筛选—药物发现的关键环节—高新技术集中的焦点TheEvolutionofHTS高通量筛选的特点•快速----每天筛选上万药次•微量----筛选样品需要量为微克级•灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性•经济----筛选费用低高通量筛选的四个要素样品制备自动化HTS模型建立数据处理要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。CurrentDrugTargets•MembraneReceptors45%•Enzymes28%•HormonesandFactors11%•IonChannels5%•DNA2%•NuclearReceptors2%•Unknown7%N=483J.Drews,Science(2000)287:1962克隆PCR、RT-PCR方法从cDNA文库、EST克隆、组织和细胞的总RNA中得到关键靶基因亚克隆大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫表达系统大规模表达、纯化、复性，得到纯净重组蛋白时间光吸收NONHONHOSONHONHOOOEtSHONHONHOOEtSSCOOHHOOCNO2O2NSCOOHNO2E412nm=13,600M-1cm-1检测方法的确定、优化及高通量筛选模型的建立分子水平筛选模型建立流程模型设计•体外生化检测–通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的相互作用等•细胞水平的检测–主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。体外生化检测体外生化检测均相检测异相检测放射性检测非放射性检测放射性检测非放射性检测SPA微粒SPA微孔板显色反应检测吸收光检测荧光检测微粒方法检测过滤方法检测吸收方法检测沉淀方法检测放射免疫ELISA检测显色反应(Photometry)No2NHRONo2H2N405nm=1.06×104M-1cm-1RSNHR'OOHSNO2CO2HO2NHO2CSSNHR'OSO2NHO2CSNO2CO2H+412nm=1.4×104M-1cm-1HSNHR'OEE显色反应方法检测MetAP活性maxnmH2NNSOMetAPMet+ONHNO2HNONHNO2ProAPH2NNO2NHOHO显色反应方法检测MetAP活性H2NSNHOHSOOROHSNHOHOROHSNO2CO2HO2NHO2CSSNHOROHOMetAPMetSO2NHO2CSNO2CO2H+R=Ph,CH3=412nm以酶为靶点以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个步骤：–确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）–天然或合成的底物的确定–酶动力学–信号窗口的评价–对已知抑制剂的反应情况底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和解旋酶。细胞水平检测细胞水平检测均相检测异相检测微生物检测哺乳动物细胞检测存活检测生长/生长抑制检测报告基因检测混合检测细胞毒性和细胞增殖检测双杂交检测报告基因检测放射性检测非放射性检测放射性检测过滤方法检测放射免疫ELISA检测非放射性功能检测荧光成像检测(FLIPR)贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。FLIPRfunctionalscreeningassayLGTPGDPPLCinositolphosphatesCa2+Fluorescentdye+fluorescentsignal要素二：化合物样品库制备•结构多样性（Chemicaldiversity）•类药性（Drug-like)Lipinski规则•MW500分子量•ClogP5计算疏水常数•Hbonddonors5H键供体•Hbondacceptors10H键受体Propertiesofan“Average”DrugUndesirableCompounds•Unstable•Reactive•Michaelacceptor•Toxic•Liquid•Generalmetalchelator•Polyaromatic•metallocompound筛选样品来源•传统化学合成、分离–合成化合物–分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位•组合化学合成–从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物库•与其他机构的合作、交换或购买传统化学合成和分离•单个合成、分步纯化•一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百个特点：数量相对较少，但各化合物相关数据全，质量较高对特定的靶点SAR明确，对一个全新靶点，这些知识有助于产生新的先导化合物发掘天然产物资源大自然是另外一个能提供具有结构多样性小分子有机化合物的主要来源。–经典方法---分离纯化、结构鉴定、活性测试---费时、效率低，远远不能满足现代高通量筛选的需要。这在一定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药物研究中受重视程度。–从结构多样性的角度考虑，大自然可能给予我们的结构多样性大大高于组合化学，因而天然产物或天然来源的样品的重要性不容忽视。这也是现代天然产物化学研究的新的切入点。天然化合物库（NatureProductPool）尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过，但至今没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱筛选过的事实似乎给我们这样一种信息：随着新的药物筛选模型的不断涌现，一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。天然产物对新药发现和开发的重要性•天然产物，特别是植物中的天然产物作为药物用途的历史非常古老，为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？•为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？•为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合物产生了兴趣？为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？化学家和生物化学家对次级代谢产物（所有非蛋白天然产物）的产生提出了六种主要的假设，Haslam归纳如下：1）次级代谢产物是无特定生理功能的单纯排泄物；2）次级代谢产物曾经起过功能代谢作用，但目前其作用已失去；3）次级代谢产物是所有体内变化的产物，在生物体内没有任何真正的作用；4）次级代谢产物是进化过程中的一例，在新化合物产生之前，次级代谢物是为了保存进化所必需的物质而存在；5）次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用的场所，重要的是次级代谢过程，而不是次级代谢产物；6）次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质，对生物体的生存具有重要作用。为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？•20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期有效合成上万个化合物成为可能；•随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展，每天可以筛选50000个以上的样品，为组合化学合成的样品提供一种快速筛选方法；•天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料获得不易。天然产物研究的复活•天然产物研究的成功•天然产物研究的独特性•新筛选方法的影响根据新药的研发过程设计有效的天然产物研究方法•天然材料的获得和提取•有效的筛选方法•天然生理活性物质的分离•快速有效的结构解析方法•生物学的评价•天然生理活性物质的大量获得•构效关系研究天然产物或其类似物作为药品实例61%of877smallmoleculedrugsintroducedworldwideduringtheperiod1981-2002canbetracedto,orwereinspiredby,naturalproducts.洛伐他汀(Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）R1MeHOMeOOOHOHMeR2HCompactin:R1=R2=HMevinolin:R1=CH3,R2=HSimvastin:R1=CH3,R2=CH3NMeMeCO2HFHOHNOOHOHCO2HFHOHNMeMeMeMeMeONMeMeOHCO2HFHOHMeHOMeOONaO2CHOHMeHOHHOPravastatinFluvastatinCerivastinAtorvastin环孢菌素A（CyclosporineA）NNHHNNOOOOHNOONHNNNOOOOONHOH真菌Trichodermapolysporum分离抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂紫杉醇HAcOBzOOOHOR1OHOOOOHNHR21.PaclitaxelR1=Ac,R2=Bz2.DocetaxelR1=H,R2=Boc2'3'1013紫杉醇(1,Paclitaxel,Taxol)是从太平洋红豆杉Taxusbrevifolia树皮中提取分离得到的天然二萜化合物。多西紫杉醇(2,Docetaxel,Taxotere)是在紫杉醇的结构修饰和改造过程中通过半合成方法得到的。2001年全世界紫杉醇年销售额在20亿美元以上，多西紫杉醇年销售额达到10亿美元以上。这两种药物已经成为当前，也是历史上最为畅销的抗癌药物。NNOR1R2R3OOHOH3CNNOO喜树碱及其衍生物CamptothecinR1=R2=R3=HTopotecanR1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OHIrinotecanR1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)9-AminocamptothecinR1=R3=H,R2=NH29-NitrocamptothecinR1=R3=H,R2=NO2(A)喜树碱及其衍生物是DNA局所异构酶Ⅱ(DNAtoposomeraseⅡ抑制剂。ROOHOHNCH3HOOHHOH3CONCH3NHOCH3CH3HHCH3H3C吗啡生物碱Morphine,R=HCodeine,R=CH3Buprenorphone,活性为Morphine25－50倍，成瘾性低于吗啡。Pentazocine,活性仅为吗啡的30％，但成瘾性极低天然产物研究的未来利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天然产物库”多样性导向合成(diversity-orientedsynthesis)Galanthamine四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂及高尔基-质膜运输抑制剂SecramineA的发现ShairMDandKirchhausenT.Naturechemicalbiology,2006,2:39-462527compoundsweresynthesizedCompoundStorage•Solid–Long-termstorage•DMSOsolution–Long-termstorage(10year?)–WorkingsolutionsCompoundplates•MotherPlates–DMSOsolutionsfromvendors•DaughterPlates–DMSOsolutions–1mg/ml•AssayPlates–Aqueoussolutions–25µg/mLcompound–2.5%DMSO–20µL123456789101112ABCDEFGH123456789101112131415161718192021222324ABCDEFGHIJKLMNOP80Compounds352Compounds88CompoundsSamplemanagementtechnology