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实验九细菌的代谢产物实验目的要求1、掌握细菌糖发酵试验、IMViC试验、硫化氢试验、尿素分解试验的原理、结果判断及医学意义；2、熟悉上述试验的操作方法。[材料]1、菌种：大肠杆菌、伤寒沙门菌、痢疾杆菌、变形杆菌培养物；金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌培养物；铜绿假单胞菌培养物；2、培养基：SS平板、EMB、克氏双糖培养基、生化反应管、普通琼脂平板、血平板；其他：接种环、接种针、酒精灯、培养箱等。标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板（一）SS琼脂平板（1）营养物质：牛肉膏、蛋白胨（2）抑制剂：胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病原菌的生长。（3）鉴别用糖：乳糖（4）指示剂：中性红（5）原理：肠道杆菌均能分解葡萄糖产酸，但大多数非致病菌又能分解乳糖产酸产气，而致病菌不分解乳糖。据此，在培养基中加入乳糖和指示剂，制成鉴别培养基。中性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。一、分离培养大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红显色，菌落大而混浊，呈现红色．志贺氏菌属和沙门氏菌属的细菌不分解乳糖，而分解蛋白质产生碱性物质，菌落形态为光滑微黄透明，园形、中等大小，边缘整齐的菌落。由于宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖(产酸)较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色的较大或边缘不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌因产生硫化氢，使菌落呈现黑色中心。SS或EMB培养基生长现象观察大肠杆菌伤寒杆菌痢疾杆菌变形杆菌SS菌落的形态特征EMB菌落的形态特征组成：无糖培养基＋乳糖＋伊红＋美蓝底物指示剂、抑菌剂原理：细菌乳糖产酸：伊红＋美蓝紫黑/紫红结果：分解乳糖细菌菌落变黑，有金属光泽不分解乳糖细菌菌落无色、半透明（粉色）分解（二）伊红美兰（ＥＭＢ）选择培养基实验主要内容：一、糖发酵试验二、IMViC试验（I:吲哚（indol）试验，M:甲基红（methylred）试验，V:V.（Voges-Proskauer）试验；C:柠檬酸（citrateutilization）实验(枸橼酸盐)，i是为个好读加上去的.）三、硫化氢试验四、尿素分解试验五、细菌的色素产生六、其他二、生化反应对糖的分解对蛋白质的分解枸橼酸盐利用试验（C）尿素酶试验甲基红试验（M）吲哚试验（I）硫化氢试验糖发酵试验VP试验（V）其他试验（一）单糖发酵试验原理：细菌具有多种酶系统能分解糖类，产酸产气。不同的细菌对各种糖类的分解不同，因而可以利用糖发酵进行各种细菌(特别是肠道细菌)的鉴别。大肠杆菌能发酵乳糖产酸；分解葡萄糖产酸产气；痢疾杆菌、沙门氏菌、变形杆菌则不能乳糖（乳糖除宋内氏迟产酸外均不产酸产气）；分解葡萄糖产酸不产气(仅福氏6型可产少量气)二、生化反应葡萄糖发酵试验中性红指标剂显色范围：中性环境：红色酸性环境：黄色葡萄糖HCOOH脱氢酶CO2+H2如大肠杆菌、变形杆菌产酸产气痢疾杆菌、伤寒沙门菌缺少此酶，产酸不产气。溴甲酚紫指标剂显色范围：中性环境：紫色酸性环境：黄色乳糖发酵试验中性红指标剂显色范围：中性环境：红色酸性环境：黄色大肠杆菌分解乳糖产酸产气；痢疾杆菌、伤寒沙门菌、变形杆菌不分解乳糖，不产酸不产气。溴甲酚紫指标剂显色范围：中性环境：紫色酸性环境：黄色（二）IMViC试验原理：IMViC试验是一组用于肠杆菌科细菌鉴别的实验，由靛基质试验、甲基红试验、VP试验和枸橼酸盐利用试验组成。靛基质试验：大肠杆菌阳性；变形杆菌阳性；痢疾杆菌阴性、沙门菌阴性；甲基红试验：四种肠道杆菌均为阳性；VP试验：除变形杆菌部分菌株阳性外，其余均为阴性；枸橼酸盐利用试验：大肠杆菌和痢疾杆菌阴性，变形杆菌以阳性为主，伤寒沙门菌阴性，副伤寒沙门菌和其它沙门菌部分阳性。（一）基本原理1.吲哚实验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。2.甲基红实验是用来检测葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。3.伏-普实验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。4.柠檬酸盐试验是用来检测细菌利用柠檬酸的能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使pH升高，培养基颜色变化。靛基质试验阳性阴性对照甲基红试验甲基红指示剂PH低于4.5，呈红色甲基红指示剂PH高于5.4，呈黄色大肠杆菌、变形杆菌阳性；痢疾杆菌、沙门菌阴性；四种肠道杆菌VP均为阳性VP试验枸橼酸盐利用试验组溴麝香草酚蓝指示剂酸性呈绿色碱性呈蓝色；利用枸橼酸盐生成碳酸盐培养基呈碱性反应四种肠道杆菌VP均为阴性（三）硫化氢试验原理：某些细菌能分解培养基中硫氨基酸（如胱胺酸）产生疏化氢、硫化氢与硅酸亚铁中的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，变形杆菌，伤寒杆菌能产生硫化氢，生成黑色沉淀物；大肠杆菌、痢疾杆菌不产生硫化氢；硫化氢试验阴性。（四）尿素试验原理：变形杆菌含有尿素酶，经2—4小时培养能分解培养基中较多量尿素产生大量的氨，使培养基PH变为硷性，而呈现红色。即阳性反应，阳性反应可弃之。痢疾杆菌属及沙门氏菌属之细菌不能分解尿素而不呈现碱性反应即阴性反应，阴性反应需继续作生化反应及血清学试验。（五）克氏双糖铁斜面培养基反应试验组成：基础培养基＋1份葡萄糖＋10份乳糖＋铁盐＋酚红营养底物底物底物指示剂(酚红指示剂:酸性时黄色,碱性时红色)原理：(1)只分解葡萄糖产酸（葡萄糖少，产酸量少）(2)分解葡萄糖＋乳糖产酸（乳糖多，产酸多）上下层均为黄色(3)产生H2S＋铁盐FeS培养基成黑色上层氧化呈红色下层缺氧不氧化呈黄色克氏双糖铁斜面培养基分解葡萄糖和乳糖只分解葡萄糖分解葡萄糖产生硫化氢对照管（六）动力试验动力试验：分别取四种肠道杆菌的培养物，用穿刺接种方法接种于4支半固体培养培养基，37℃培养18-24h以后观察结果。SS或EMB培养基生长现象观察大肠杆菌伤寒杆菌痢疾杆菌变形杆菌SS菌落的形态特征EMB菌落的形态特征[结果][结果]大肠杆菌伤寒杆菌痢疾杆菌变形杆菌克氏双糖铁培养基葡萄糖乳糖硫化氢动力尿素H2S生化反应管葡萄糖乳糖结果观察大肠杆菌伤寒杆菌痢疾杆菌变形杆菌克氏双糖铁葡萄糖乳糖硫化氢动力尿素H2S生化反应管葡萄糖乳糖+---++++-++-+---+--++++-+-黑色--黑色++++1、菌种：金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌培养物；铜绿假单胞菌培养物；2、培养基：血平板，普通琼脂平板。（七）细菌的色素产生试验表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌溶血素比较[结果]金黄色葡萄球菌白色葡萄球菌柠檬色葡萄球菌铜绿假单胞菌菌落色素溶血情况