气相色谱法测定冰激淋中的甜蜜素.

Vol.43，No.12015(total290)@163.com中国乳品工业0引言甜蜜素学名环己基氨基磺酸钠，是食品最常用的甜味剂之一。自首次推广应用以来，其安全性一直倍受争议[1-2]，而争议的焦点则集中于其潜在的致癌性[3-4]和对内脏功能的损害[5]。在已经报道的检测方法中，国标法[6]的气相色谱法由于出台时间比较早，受当时实验条件等方面的影响，制订标准时在技术上受到一定的限制，与当前的实际情况相比已经显得比较落后。另外，不同种类食品本身基质特性千差万别，国标方法在前处理环节缺乏相应的针对性，造成了提取的困难。本研究针对冰激淋中蛋白质质量分数高，前处理过程中易乳化、回收率低的问题，建立了亚铁氰化钾、乙酸锌对蛋白进变性沉淀—亚硝酸酯化—GC-FID分析的检测方法。方法操作简便，测定结果准确可靠，易于推广。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂甜蜜素标准品（纯度99%），正己烷（色谱纯），其他试剂均为分析纯，去离子水。气相色谱法测定冰激淋中的甜蜜素张志强1，张秀丰2，张玉娟1，崔同3（1.邢台出入境检验检疫局，河北邢台054000；2.衡水出入境检验检疫局河北衡水053000；3.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）摘要：建立了气相色谱法测定冰激淋中甜蜜素质量分数的分析方法。用亚铁氰化钾、乙酸锌溶液对样品进行蛋白变性沉淀，甜蜜素在酸性、低温环境下与亚硝酸钠发生酯化反应，酯化反应产物经毛细管色谱柱分离，由氢火焰离子化检测器（FID）测定。重点考察了不同提取方式的提取效率和不同蛋白沉淀剂对加标回收率的影响，在此基础上优化了前处理方法。方法的检出限为2mg/kg(S/N=3)。在加标水平为0.10，0.50和1.00mg/g时的平均添加回收率为93.0%～95.8%，相对标准偏差3.44%～5.16%。酯化反应产物峰面积与甜蜜素质量浓度在0.05～1.00g/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R2=0.9996。该方法操作简便快速，灵敏度高，测定结果准确、可靠，适合冰激淋中甜蜜素质量分数的测定。关键词：气相色谱；冰激淋；甜蜜素中图分类号：O657.7+1，TS277文献标识码：A文章编号：1001-2230（2015）01-0047-04DeterminationofsodiumcyclamateinicecreambygaschromatographyZHANGZhi-qiang1，ZHANGXiu-feng2，ZHANGYu-juan1，CUITong3(1.XingtaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Xingtai054000，China；2.HengshuiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Hengshui053000，China；3.CollegeofFoodScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baodin071001，China)Abstract:Amethodforthedeterminationofsodiumcyclamateinicecreambygaschromatographywasdeveloped.Proteininsampleswasdenaturizedandprecipitatedbypotassiumferrocyanideandzincacetate.Sodiumcyclamatewasesterifiedwithnitritesodiumunderacidandlowtemperatureenvironment.Theesterifiedproductwasseparatedbycapillarychromatographiccolumnandanalyzedbyflameionizatorde⁃tector.Theefficienciesofdifferentextractionmethodsandtheeffectsofdifferentprecipitatingreagentsonrecoveryweremainlyinvestigated.Thepre-processingmethodwasoptimizedbasedontheresearchresults.Thedetectionlimitis2mg/kg（S/N=3）.At0.10,0.50and1.00mg/gfortificationlevels，theaveragerecoveriesrangefrom93.0%to95.8%withtherelativestandarddeviationsfrom3.44%to5.16%.Itshowsgoodlinearityovertherangeassayed0.05to1.00g/L（R2=0.9996）.Themethodissuitablefordeterminationofsodiumcyclamateinicecreamwithrapidity,sensitivityandaccuracy.Keywords：gaschromatography；icecream；sodiumcyclamate收稿日期：2014-07-08作者简介：张志强（1986-），男，助理工程师，从事食品安全检测与研究。通讯作者：崔同472015年第43卷第1期（总第290期）测定方法InspectionMethods亚铁氰化钾溶液（106g/L），乙酸锌溶液（220g/L）三氯乙酸溶液（150g/L），硫酸溶液（100g/L），亚硝酸钠溶液（50g/L）。1.1.2仪器与设备气相色谱仪（GC2010）配FID检测器，自动进样器及RTX-5毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），电子天平（BP3100），离心机（TDL-40最高转速4000r/min）；旋涡振荡器，超声清洗仪，高速均质器（IKAT25）。1.2方法1.2.1样品的处理准确称取冰激淋试样5g（精确到0.01g）于50mL离心管中，加入去离子水20mL，亚铁氰化钾和乙酸锌溶液各1.0mL，旋涡振荡使试样充分融化、混匀，全部转移至50mL容量瓶中，定容后摇匀。上清液经滤纸过滤，取10mL滤液于50mL离心管中，置冰浴中，先后加入2.5mL硫酸溶液、2.5mL亚硝酸钠溶液，旋涡振荡1min，冰浴30min（期间不时振摇），然后加入5mL正己烷，2.5g氯化钠，旋涡振荡1min，4000r/min离心5min，取己烷层上机测定。1.2.2标准品的处理精确称取0.25000g甜蜜素标准品，用去离子水溶解并定容至50mL，配制成质量浓度5.0g/L的标准储备液。分别吸甜蜜素标准储备液0.10，0.20，0.50，1.00，2.00mL于50mL离心管中，加入去离子水至10.0mL，相当于每个离心管中甜蜜素的质量浓度分别为0.05，0.10，0.25，0.50，1.00g/L,以后按“1.2.1”中“置冰浴中，先后加入2.5mL硫酸溶液……”起依法操作。1.2.3色谱条件程序升温为初始温度50℃保持1min，以10℃/min速率升至60℃，再以20℃/min速率升至200℃，保持1min；进样口温度为200℃；检测器温度为220℃；柱流量为2.42mL/min；氢气流量为35mL/min；空气流量为350mL/min；尾吹流量：30mL/min；分流进样（分流比为39∶1）；进样量1μL。2结果与分析2.1酯化反应条件的控制前处理是色谱分析中耗时最多也最容易引起误差的环节[11]。本方法的检测原理为：冰浴条件下，在硫酸介质中甜蜜素与亚硝酸钠反应，生成环己醇（副产物），在硫酸介质中进一步生成环己醇亚硝酸酯（主产物），利用气相色谱法进行定性和定量[12]。其中酯化反应与pH值、亚硝酸钠浓度、温度、反应时间等因素密切相关，稍有变化，结果就有可能出现偏差。因此在检测过程中应严格按照1.2.1所描述步骤进行处理，保证所有标准品及样品处理条件的一致性。本方法条件下副产物产量极小，因此，方法以主产物作为定量依据。甜蜜素标准品酯化产物分析图谱如图1所示。图1中，峰1为酯化反应主产物环己醇亚硝酸酯，峰2为副产物环己醇。2.2提取方式的选择称取5g已知阴性样品作为空白本底，加入甜蜜素标准品2.5mg，分别采用旋涡振荡法、高速匀浆法和超声法提取，最终加标回收结果如表1所示。结果表明，旋涡振荡法和高速匀浆法的提取效率相当，超声提取法略低。综合考虑操作的便捷性，本方法采用旋涡振荡的提取方式。2.3蛋白沉淀剂的选择冰激淋样品不沉淀蛋白直接酯化时提取液浑浊，发生乳化现象，有机相和水相难以分层，回收率低，因此，须预先对样品进行蛋白沉淀。亚铁氰化钾、乙酸锌溶液（以下称沉淀剂Ⅰ）和三氯乙酸溶液（以下称沉淀剂Ⅱ）是实验室常用的两组蛋白沉淀剂。试验考察了两组沉淀剂对冰激淋样品中的蛋白沉淀效果以及加标回收情况。其中沉淀剂Ⅰ的使用方法见1.2.1，沉淀剂Ⅱ的使用方法为用其直接对5g冰激淋样品溶解并定容至50mL，其余步骤按1.2.1操作。两组沉淀剂考察结果如表2所示；使用不同沉淀剂后的酯化反应色谱如图2所示。结果表明，样品经蛋白沉淀过滤后，提取液清澈，酯化反应未发生乳化现象，有机相与水相分层明显；两种蛋白沉淀剂比较，使用沉淀剂Ⅰ时，平均加标回收率达到95.8%，而使用沉淀剂Ⅱ时，平均加标回收率仅为48.8%。由图2可知，三氯乙酸的使用改变了酯化反应的平衡，使主产物环己醇亚硝酸酯减少，而副产物环己醇增加，造成定量的失准。因此，本方法采用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为蛋白沉淀剂。此外，试验还考察了亚铁氰化钾和乙酸锌溶液用量对蛋白沉淀效果及酯化反应产物产量的影响，结果如图3所示。试验表明，当沉淀剂用量为各1.0，1.5，2.0，2.5，3.0时，蛋白均完全沉淀，且酯化反应产物峰面积基本一致。1.0mL的沉淀剂用量已完全能够满足检测需求。图1甜蜜素标准品酯化反应产物色谱注：n=6。提取方式旋涡振荡法高速匀浆法超声提取法提取时间/min1120回收率/%95.895.092.6RSD/%4.074.954.75表1不同提取方式对回收率的影响48Vol.43，No.12015(total290)2.4正己烷提取液中酯化反应平衡的改变前处理完成后，正己烷提取液在放置过程中，酯化反应的平衡会随时间发生改变，酯化反应主产物与副产物之间存在此消彼长的关系。试验对2.5mg甜蜜素标准品的酯化反应提取物，在前处理完成后0，2，10，24h分别进行测定，得到酯化反应产物峰面积与放置时间的关系，如图4所示。结果表明，随正己烷提取液放置时间的延长，酯化反应平衡发生改变，主产物逐渐减少，而副产物逐渐增多。因此，前处理完成后应立即进行测定，尽可能减小检测的误差。2.5线性范围和检出限以甜蜜素的浓度为横坐标，酯化反应产物的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为：y=388067x+6622.5（R2=0.9996），表明质量浓度在0.05~1.00g/L范围内，呈良好的线性关系。以3倍信噪比计算，方法的检出限为2mg/kg，远远满足我国0.65g/kg的限量要求[13]。2.6精密度和回收率选取一种已知未检出甜蜜素的冰激淋样品，采用标准加入法分别测定0.10，0.50，1.00mg/g三个加标水平下甜蜜素的加标回收率，分别平行测定6次，结果如表3所示。结果表明，本方法的精密度和回收率良好。3结论本试验建立了亚铁氰化钾、乙酸锌对蛋白进变性沉淀—亚硝酸酯化—GC-FID分析的方法测定冰激淋中的甜蜜素，具有提取效果好、回收率高、稳定性好、操作简便快速的特点，完全能够满足对冰激淋中甜蜜素质量分数测定的要求，具有较好的应用、普及和推广价值。参考文献：[1]COLLINGSAJ.Metabolismofcyclamateanditsconversiontocyclo⁃hexylamine[J