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PacBioRSII单分子实时测序系统具有超常读长、组装结果高准确度、可检测碱基修饰等优势特点，可广泛应用于基因组测序、甲基化测序、全长转录本测序等项目。详见：单分子实时测序原理PacBioRSII单分子实时测序（singlemolecule,real-time，SMRT）测序反应是在其专利SMRTcell中进行的，每个SMRTcell中有150,000个ZMW（纳米级的零模波导孔zero-modewaveguides）,每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链，SMRTCell能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。当测序进行时，专利的包被技术保证DNA聚合酶和模板形成的复合体被锚定在ZMW的底部，反应溶液中带有标记着不同荧光磷酸基团的高浓度核苷酸，检测装置则透过ZMW底部的基层来实时观察DNA的合成过程，不同荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链时，其荧光可在DNA链检测到，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。专利DNA聚合酶不受激光对其造成的损伤及核苷酸标记荧光影响，可较长时间保持酶活性，实现超长读长，且当荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化学键时，DNA聚合酶可切除其荧光基团，荧光消失。ZMW外径比检测激光波长小，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围(体积20X10-21L)里,正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。此外，PacBioRSII测序可以通过检存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，如果碱基PacBioRSII测序优势•在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度；•样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCRartifacts.•对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件下，读长超过经典的Sanger测序法；•NGS读长在35-700bp之间，而PacBioRSII平均测序读长能得到更完整精确的组装结果达到3-10kb，最长的序列能达到20kb，超长读长可轻松跨越重复序列，轻松；1.超长的测序读长2.极高的准确率3.最小的GC偏向性（GCbias）4.无PCR扩增偏向性PacBioRSII测序的应用PacBioRSII测序系统无需PCR的建库技术，大大减少了高GC基因组所带来的偏好影响；领先的超长测序，reads读长4kb，有效提高基因组组装精准度和完整性，可更精确检测基因组变异及修饰情况，更适用于生物基因组研究。上海翰宇除了拥有常规的二代高通量测序平台IlluminaHiSeq2500;MiSeq;454GS-FLXPlus以外，我们还拥有华东地区第一台PacificBiosciences公司研发的PacBioRSII单分子实时测序系统。该测序平台应用与生物基因组测序，可得到最高的N50组装指标、最少的contigs数量和高达99.999%准确率的测序结果。同时，我们是目前国内做微生物测序最多的单位之一，已经完成了400多株微生物基因组测序，近100株细菌的完成图，合作单位发表的SCI文章已有30余篇，具有丰富的专业分析经验。基因组测序转录组测序是指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而得到一个样品中所有RNA的信息，得到基因的全长转录本是科学研究工作者梦寐以求的测序结果，但碍于现有序列拼装技术限制，得到全长转录本的数量、准确度和完整性大打折扣，PacBioRSII测序平台，可根据不同实验目的，构建不同cDNA文库，借助其超长读长优势，一次性得到更精准完整的全长转录本。全长转录组测序表观遗传学研究是现代科学研究热点，全基因组上的甲基化修饰检测更是热点中的焦点，PacBioRSII根据修饰碱基与未修饰碱基通过聚合酶的动力学变化，识别碱基修饰情况。PacBioRSII目前可检测甲基化修饰类型包括：4mC,6mA,5mC；优势：无需进行DNA扩增，可检测甲基化与半甲基化位点；单碱基分辨率；无需专门处理，可直接进行碱基修饰检测测序；可发现未知修饰；碱基修饰测序PacBioRSII样本准备要求一、测序所需样品量所需的测序样品的量会根据SMARTBell模板制备时插入片段的大小不同而不同。根据样品的提取质量，在片段化以及检测浓度的过程中，大概会有20%的样品损失。因此，请确保有足够的起始DNA样品从而可以进行后续的流程。二、样品要求1.DNA样品纯度：260/280比值接近1.8，260/230比值为2.0~2.22.DNA样品浓度：对于PacBio测序的样品，建议使用PicoGreen染色或用Qubit分光光度计（LifeTechnology）进行检测三、样品储存和运输要求1.DNA样品可溶解于Tris缓冲液中（如10mMTris，PH为7.0~8.0）或无核酸酶的水中，样品的最大体积不得超过130ul，溶解用的缓冲液中不含EDTA。2.纯化的DNA样品非常稳定，建议以冷冻（干冰）的方式运输样品，一方面保证无细菌污染，另一方面也可以减少样品的挥发。3.确保样品为双链DNA。单链DNA不能进行SMARTBell模板制备，且会影响定量和聚合酶的结合4.尽量避免样品多次冻融，确保样品没有在大于65度的环境中放置，没有暴露在高酸性或高碱性条件下(PH6或9)和UV环境下。5.确保样品不含有不溶的物质，RNA，螯合剂（如EDTA），二价金属阳离子（如Mg2+），变性剂（如胍盐，苯酚）或去污剂（SDS，Triton-X100）。四、操作DNA时的注意事项1.乙醇沉淀后避免DNA过于干燥，让DNA在空气中自然干燥。2.应使用RNAase-free的水或其他适合的溶液溶解DNA。3.为帮助DNA溶解，可小心翻转小管数次，或用手指轻弹管的底部，或者也可以将样品放置于2-8度的环境下过夜溶解。5.请勿涡旋震荡DNA样品，因为该操作会导致DNA片段化。6.将DNA样品在65度加热10分钟，以使DNASE失活。确保加热时间不超过10分钟，否则可能导致DNA的损伤。同时，请勿反复冻融DNA样品。