第五章-层析分离技术

1第五章层析分离技术Inordertopurifyproteins,peptidesandnucleicacidsweneedpowerfultechniques.2概念：层析技术(又称：色谱技术)是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。层析技术的原理3层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。4一、层析的原理层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。第一节层析概述56二、层析的分类按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析7根据流动相的形式：液相层析、气相层析8层析分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的层析方法：按机理分为：–吸附层析–分配层析–离子交换层析–凝胶层析–亲和层析根据分离作用机理的分类GelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinityReversedPhase9凝胶过滤原理吸附层析疏水层析分配层析亲和层析离子交换10三、层析基本操作过程装置选择上样和洗脱结果检测上样均一性洗脱装置目的不同检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值111、柱层析的L/d比值122、洗脱装置不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置13改变溶剂系统♦分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析14♦梯度洗脱一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。线性梯度洗脱装置♦性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢的梯度洗脱→若为单峰：分级洗脱153、结果检测活性检测比活没有提高目的蛋白与杂蛋白并没有分开比活有所提高，但总活性回收很低目的蛋白有损失或有失活现象测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性16结果保存薄层层析&纸层析照相保存or扫描仪转为图形or积分仪变成数据柱层析检测器、记录仪和积分仪处理174、层析装置的仪器化HPLC与微机、质谱等连用18四、层析前蛋白质处理主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。191、盐析法盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。202、等电点沉淀在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。213、有机溶剂沉淀降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀；有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。22五、层析系统的基本概念及要求ResolutionEfficiencySelectivitySymmetry23层析分离的基本概念分配系数可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度cqKd24层析分离的基本概念滞留时间（tR）和滞留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一25层析分离的基本概念洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异sdmeVKVV26层析分离的基本概念ResolutionfactorRsRs=4Rs=0.6Rs=1RVVWWsrr21122Resolution=PeakseparationPeakwidthat½height分辨率（Resolution,Rs）27层析分离的基本概念Resolution:dependsonefficiencyandselectivityHighefficiencyLowefficiencyHighselectivityLowerselectivityEfficiency:IsameasureofpeakwidthHighefficiencymeanssharppeaksHighefficiencymeansagoodpackedcolumnHighefficiencycancompensateforlowselectivitySelectivity:IsameasureofpeakseparationHighselectivitygivesbaselineseparationsIfselectivityishigh,lowefficiencycanbetolerated(iflargepeakvolumeisacceptable).28层析分离的基本概念22/1)(54.5WtNR色谱柱的理论塔板数N与高度HN---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽理论塔板高度：L---柱长VrWh=PeakwidthathalfpeakheightAU280NLH29层析分离的基本概念Efficiencydependson:ParticlesizeofmatrixParticlesizedistributionofmatrixPackingqualityofthecolumnSample(volumeandviscosity)Flowrate30Resolution:thepowertoseparatepeaks200400ml0MaximumnumberofpeaksinRPC15001020mlMaximumnumberofpeaksingelfiltrationca15Remember:wearenotpurifyingpeaks,butproteins&peptides!层析分离的基本概念31一、原理根据物料中各组分对固定相(吸附剂)的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程，达到分离目的。无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。第二节吸附层析32机理:样品组分对固定相表面吸附力不同进行组份分离吸附剂:Al2O3,SiO2(硅胶),聚酰胺等吸附剂和洗脱剂的选择:物质极性吸附活性洗脱剂极性强小强弱大弱33常见的吸附类型及其主要特点物理吸附：吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快。化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢。34常用吸附剂:氧化铝硅胶活性炭纤维素聚酰胺硅藻土装柱加入样品层析后常用洗脱剂极性次序:石油醚环己烷CCl4甲苯CH2Cl2CHCl3乙醚醋酸乙酯正丙醇乙醇甲醇水35二、常用吸附剂种类吸附剂通常应具备以下特征：对被分离的物质具有较强的吸附能力有较高的吸附选择性机械强度高再生容易、性能稳定价格低廉。36常用吸附剂硅胶氧化铝聚酰胺活性炭大孔吸附树脂371、硅胶颗粒表面存在的很多硅酰基作为活性中心与所进行层析的化合物形成强的氢键作用硅酰基能够通过氢键的形成而吸附水分，并随着吸着的水分增加而降低吸附力3839活化加热至100～110℃，除去硅胶表面因氢键所吸附的水分当温度升高至500℃时，硅酰基脱水缩合转变为硅氧烷键，不再有吸附剂的性质再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，110℃烘干活化处理402、氧化铝多孔的A1203的聚合物，吸附性能也可通过改变其含水量加以控制。优点：吸附容量较高、价格低廉等缺点：具有催化性能。碱性条件下不稳定的化合物分离时容易发生诸如异构化、氧化和消除等次级反应41酸性氧化铝pH值约为4.0，分离酸性化合物如羧酸类碱性氧化铝pH值约为10.0，分离诸如生物碱类的碱性化合物中性氧化铝pH约为7.0，分离相对非极性的化合物如类固醇42活化200℃左右加温4～6小时再生弃去柱顶端的加样部位后，依次用甲醇、稀乙酸、氢氧化钠溶液和水洗涤，再经高温(200℃)活化433、聚酰胺尼龙-6：己内酰胺聚合而成尼龙-66：己二酸与己二胺聚合而成丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等通过氢键结合而被吸附对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差应用：生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离444、活性炭吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱可分离水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物、氨基酸与肽、单糖与多糖目前，多用于在结晶过程中进行脱色和脱臭等操作中的简单吸附过程45活性炭（Activecarbon）活性炭种类颗粒大小表面积吸附力吸附量洗脱粉末活性炭小大大大难颗粒活性炭较小较大较小较小难锦纶活性炭大小小小易46粉末活性炭47锦纶活性炭48活性炭对物质的吸附规律活性炭是非极性吸附剂，因此在水中吸附非极性溶质的能力大于有机溶剂中的吸附能力。针对不同的物质，活性炭的吸附遵循以下规律：（1）对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物（2）对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物（3）对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物（4）pH值的影响:碱性中性吸附酸性洗脱酸性中性吸附碱性洗脱（5）温度:未平衡前随温度升高而增加495、大孔吸附树脂六十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，不含交换基团、具有多孔网状结构和较好的吸附性能的非离子型共聚物大孔吸附树脂同时兼有吸附性和筛选性，其吸附性是由于范德华力或氢键作用的结果，而筛选性是由于它具有多孔网状结构50树脂——大孔网状吸附剂特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。但价格昂贵，吸附效果易受流速以及溶质浓度等因素的影响。51非极性树脂由偶极矩很小的单体聚合而成，不带任何功能基，适于从极性溶液中吸附非极性物质，主要依靠分子中亲脂键、偶极离子及氢键的作用中等极性树脂含酯基，对于极性物质和非极性物质都具有吸附作用。极性吸附树脂含酰胺基、腈基、酚羟基及含氮、氧、硫极性功能基。5253大孔吸附树脂的吸附机理非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附各种有机物，其吸附能力与树脂的化学结构、物理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循以下规律：非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质；极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质；中等极性吸附剂兼有以上两种能力54吸附等温线概念：当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等