第二章-层析分离技术-张静

第二章层析分离技术1903年俄国植物学家M.Tswett将含有植物叶子色素的溶液，通过装填有白垩（碳酸钙）粒子吸附剂的柱子后，各种色素被分开。证明植物叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。分开的色素形成不同的色带，因此称为色谱法（Chromatography），又称层析法。碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤到1931年色谱法才用于分离复杂的有机混合物。柱层析很难鉴定微量物质，因此发展了纸层析法（PaperChromatography，简称PC）。在这种“平面”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。利用平面层析法的优点发展了薄层层析法（Thin-LayerChromatography，TLC）。薄层层析的分离是在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。通过施加电场可提高纸层析或薄层层析对离子化合物的分离效率，这种改进方法被称为纸上电泳或薄层电泳。1941年英国生物学家Martin和Synge提出色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱（Liquid-LiquidpartitionChromatography）。Martin(马丁)和Synge(辛格)预言：①流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；②使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高（增加理论塔板数），将会提高分离效率。气相色谱仪是1952年Martin和James发展起来的层析法，适用于分离气体混合物或挥发性液体和固体。具有分辩率高、分析迅速和检测灵敏等优点。上世纪60年代末产生了高效液相色谱（High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC），适用于快速分离非挥发性或热不稳定样品。色层分析法已不限于分离有色物质，但色谱法或色层分析法的名称仍被沿用。现称为层析法或层析技术。层析法的特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。既可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。层析法作为一种分析分离手段与方法，广泛用于科研与工业生产上。如在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域发挥重要作用。层析分离技术原理层析法是利用待分离混合物中各组分物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速度不同而被分离。例如：利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数不同，达到彼此分离的目的。分配系数是在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。K=Cm/CsCm是流动相中的浓度，Cs是固定相中的浓度。分配系数主要与被分离物质的性质、固定相和流动相的性质以及层析柱的温度有关。一般情况下，分配系数与温度成正比。对于K值相近的不同物质，可通过改变温度来增大K值间的差异，达到分离的目的。所有层析系统都由两个相组成：①固定相是层析的一个基质。为固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）或是固定于固体物质上的成分（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。基质可与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。对层析效果起关键作用。②流动相是层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。如水和各种溶剂。柱层析中的流动相一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。分配系数不同的物质在层析时的迁移率不同。迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。用Rf来表示。Rf值是衡量各组分的分离情况的数值，Rf值在0～1之间，Rf值相差越大，分离效果越好。层析的效果可用分辨率Rs表示，Rs是相邻两组分（峰）的分开程度。Rs：相邻二组分的色谱峰保留值（洗脱体积）之差与峰宽总和的一半的比值。21211222WWYWWVVRRRSRs值越大两组分分离的越好。当Rs=1时两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达99.8%。若两组分浓度相差较大时，则要求较高的分辨率。影响分辨率的因素是多方面的，应根据实际情况综合考虑，对于生物大分子还需考虑其稳定性和活性等。如pH值、温度等都会产生较大的影响。在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时存在于基质上的饱和容量称为操作容量。操作容量越大，表明基质对该物质的亲合力越强。由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响，同种基质对不同分子的操作容量不同。实际操作时上样量要小一些，特别要控制生物大分子样品的加入量，否则不能有效分离。层析法的分类①按两相所处的状态分类流动相有3种状态：液体作为流动相的称液相色谱（liquidchromatography）；气体作为流动相的称为气相色谱（gaschromatography）。当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时称超临界色谱。固定相有两种状态：以固体吸附剂作为固定相；以附载在固体上的液体作为固定相。按固定相不同分为：液－固色谱（liquid-solidchromatography）、液－液色谱（liquid-liquidchromatography）、气－固色谱（gas-solidchromatography）、气－液色谱（gas-liquidchromatography）。②按层析原理分类吸附层析（adsorptionchromatography）：以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂间的吸附力不同而达到分离的目的。分配层析（partitionchromatography）：在有两相同时存在的溶剂系统中，由于不同物质的分配系数不同从而被分离。离子交换层析：(ion-exchangechromatography)以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离。体积排阻色谱（即凝胶层析，gelchromatography）：以具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据物质的分子大小进行分离。亲和层析法：根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。③按固定相附着方式不同分类柱层析（columchromatography）、纸层析（paperchrmatography）、薄层层析（thinlayperchromatography）和薄膜层析法。④根据极性分类反相色谱：流动相极性＞固定相极性，极性大的分子比极性小的分子移动速度快，先从柱中流出。正相色谱：流动相极性＜固定相极性，非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出。一般分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱，分离纯化极性小的有机分子多采用反相色谱。层析法的特点与应用特点：①层析法与光学、电学或电化学仪器联用，可检测出层析后各组份的浓度或质量；可用于定性及定量测定，同时绘出层析图，②与电子计算机联用可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。③分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快。应用：层析法适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。第一节吸附层析基本原理定义：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物各组分分离的方法。吸附剂的选择常用的吸附剂除氧化铝、硅胶外，还有活性炭。吸附剂的种类很多，而对吸附剂的选择尚无固定的法则，一般需通过小样实验来确定。装柱（1）干法装柱在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层干净的砂粒，打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶部平面，关紧下口活塞。（2）湿法装柱将吸附剂加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，先把放好棉花、砂子的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌人柱子。注意，整个操作要慢，不要将气泡压人吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，切勿流干，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。吸附层析的基本操作与应用上样（1）湿法上样把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞口。（2）干法上样多数情况下，被分离物质难溶于最初使用的洗脱剂，这时可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。洗脱在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常为50mL。但若所用洗脱剂极性较大或各成分的结构很近似时，每份的收集量要小。整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的溶液流干，即吸附柱上端要保持一层溶剂。此外，应控制洗脱液的流速，流速不应太快。若流速过快，柱中交换来不及达到平衡，因而影响分离效果。1.2聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方法。它可用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、环酮、杀虫剂和维生素B等16类化合物的分析。基本原理聚酰胺对极性物质的吸附作用是：由于它(羰基或氨基）能和被分离物（羟基或氧原子）之间形成氢键。如:酚类(包括黄体酮、鞣酸等)和酸类是以羟基与聚酰胺的羰基形成氢键。硝基化合物和醌类则是以氧原子与聚酰胺的形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。•层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。•展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能导致分离物达到分离目的。•所以这种层析与其他层析一样，选择适当的溶液作流动相是层析获得满意结果的重要因素之一。薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。1.3薄层层析基本操作薄层板的制备样品的预处理点样、展层与显色第二节分配层析分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值：K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配。当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的次数越多，越容易被彻底分离。纸层析属于典型的分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用。本节主要通过纸层析介绍分配