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实验题目：湖水中细菌和抗Cu离子的细菌的总数测定，金属抗性细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察一、实验目的1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2.了解平板菌落计数法的原则。3.了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。4.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。5.了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。6.学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术。7.从湖水中分离、培养微生物，掌握常用的分离微生物的方法。8.学会接种技术。9.观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。10.通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的菌落特征，达到初步鉴别上述微生物的能力。二、实验原理1、测细菌总数原理：水中的细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，水体被污染的程度越重。水中细菌的种属繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中的细菌的总数实际上是一种近似值。肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长。因此应用平板菌落计数技术来测定水样中的细菌总数基本上能代表水样中细菌的数量。2、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。本实验配制固体培养基，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入质量浓度15-20g∕L的琼脂为固体培养基。3、灭菌原理:本次实验采取加压蒸汽灭菌法和干热灭菌法。加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。包括干热空气灭菌和火焰灼烧灭菌等以干热方法杀死细菌达到灭菌的目的。干热灭菌法适用于干燥粉末、凡士林、油脂的灭菌，也适用于玻璃器皿(如试管、平皿、吸管、注射器)和金属器具(如测定效价的钢管、针头、摄子、剪刀等)的灭菌。干热灭菌的原理是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧4、分离纯化原理：本实验使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。此法加样量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，先正置一段时间等水分蒸发后倒置。5、微生物的接种原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。本次实验采取斜面接种法，使用到的接种工具是接种环，接种环一般用电炉丝或者镍丝，环的柄为金属材质，其后端套上绝热材料套。6、菌落形态观察原理：由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可从菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬、表面光滑粗糙等情况，初步辨别是何种类型的微生物。三、实验器材及试剂1.菌落总数恒温培养箱、高压蒸气锅、电子天平、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；灭菌的玻璃塞瓶1个，三角烧瓶/烧杯4个，灭菌培养皿9个，1ml移液管6支、10ml2支、试管3支，PH试纸、玻璃棒、记号笔1支,100ml量筒，滴管2支。2、分离纯化（1）样品：人工湖湖水（2）仪器：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、酒精灯或煤气灯、稀释水、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、滴管、吸水纸、镊子、搪瓷杯、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、滤纸、pH试纸和棉花、接种环、酒精灯、恒温培养箱、4大类菌落（培养皿）（3）试剂或材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂、重金属离子试剂（Cu离子试剂）等四、操作步骤1.玻璃器皿的准备（1）洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、备用。（2）包装A.移液管的包装：移液管的吸端用细铁丝（或牙签）将少许棉花塞入构成1-1.5cm长的棉塞，起过滤作用（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内）。棉塞要塞的松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。然后将塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结，待灭菌。B.培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将8套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，4套、4套相对而放）包好。2.培养基的配制（1）配制溶液取一定容量的烧杯盛入100mL蒸馏水（有时也可用自来水），按培养基配方（0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g琼脂、重金属Cu离子）逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。在制备固体培养基加热融化琼脂时要注意搅拌，避免琼脂糊底烧焦。（2）调节pH，再加琼脂一般刚配好的培养基是偏酸性的，故要用质量浓度为100g∕LNaOH调pH至7.2-7.4.应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时用pH试纸测试。调整至所需的pH。（3）分装A.分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管，用于制造斜面培养基时，一般装量不超过试管高度（15mm*150mm）的1∕5。分装时谨防培养基沾在管口上，否则会使棉塞沾上培养基而造成染菌。牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，Nacl0.5g,琼脂2.0g，水100ml,pH7.2-7.4，重金属Cu离子。B.加硅胶塞、包装后灭菌。灭菌条件：121摄氏度（相对蒸气压力为0.103MPa）,20min。（4）斜面的制作灭菌后如需制成斜面培养基，应在培养基冷却至50-60摄氏度，将试管搁置成一定的斜度，斜面高度不超过试管总高度的1∕3。3.稀释水的制备：试管稀释水的制备另取5支18mm×180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞上硅胶塞，包扎后灭菌。4.灭菌：加压蒸汽灭菌法（1）向灭菌器内加入清洁软水（蒸馏水更好）：水位应不超过水位线标志，以免水进入灭菌桶内，浸湿被灭菌物品。（2）堆放物品并注意留有空隙：将需要灭菌的物品包好后，顺序放在灭菌桶内的筛板上。（3）盖上盖子：对称地坚固螺栓，注意不宜旋得太紧，以免损坏橡胶密封垫圈。（4）打开电源置灭菌温度：通过压力-温度控制器旋钮预置，温度预置范围在120℃左右，时间控制在20分钟，顺时针方向旋转旋钮，灭菌温度预置值减小；反之，预置值增大。可根据需要确定预置灭菌温度。（5）设置灭菌时间：按照不同的需要，将计时器旋钮按顺时针方向旋至所需的时间刻度上，当达到预置的灭菌温度时，计时指示灯亮，计时器自动计时。（6）加热，排放冷空气。（7）灭菌。（8）结束（关电源）：此时切忌立即放气，一定要待指针接近“零”位时，再打开放所阀，取出物品，排掉锅内剩余水。灭过菌的培训基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或者阴凉处保存备用。5．水样的采取取距湖水面10-15cm深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。6．细菌总数测定（1）取加入9ml水的灭菌试管。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。（2）自最后一个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。（3）各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的培养基，立即放在桌上混匀。（4）凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。7.细菌的纯种分离及培养（平板表面涂布法）（1）取样：用无菌瓶从人工湖水中取一定量的湖水，迅速带回实验室。（2）融化培养基：加热融化培养基，待用。（3）稀释样品：将1瓶90ml和5管（根据预备实验数据变化）9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号。用1mL无菌移液管吸取1mL10-1浓度菌液于9mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀，即为10-2浓度菌液。同法依次稀释到10-6。（4）倒平板：将融化并冷却至50摄氏度左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板。（5）涂布：用无菌移液枪吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋转涂布均匀。（6）培养：送恒温培养箱培养（正置），如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养。8.细菌的接种（1）准备：接种前将操作台擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上，用75%酒精擦手。（2）编号：在试管上贴标签，注明菌号、接种日期、接种人姓名、组别等。贴在距试管口约2～3cm的位置。也可用记号笔注明上述内容。（3）点燃：酒精灯。（4）手持试管：将经上述分离培养后的培养皿菌落和一支含Cu离子的待接斜面培养基用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置，而且管口齐平。（5）灼烧接种环：右手先将硅胶塞拧松，以便接种时容易拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌的目的。（6）接种：在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住硅胶塞将其拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将烧过的接种环伸入菌种管内，使环端轻触内管壁，冷却后取种，立即转移至待接种试管斜面上，自斜面底部开始向上做“Z”形致密划线直至斜面顶端。抽出接种环，试管过后塞上硅胶塞，将试管放回试管架。灼烧接种环，杀灭环上细菌。送培养箱（37℃）培养，待看结果。9.菌落形态的观察（1）将自己培养筛选的细菌菌落逐个辨认并编号，按号码顺序将各细菌的菌落特征描述、记录。（2）绘制菌落形态图。（3）与细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌菌落特征进行比较主要特征细菌酵母菌放线菌霉菌菌落主要特征湿润或较湿润，少数干燥，小而突起或大而平坦较湿润，大而突起，菌苔较厚干燥或较干燥，小而紧密干燥，大而疏松或大而紧密五、数据记录1.湖水中细菌总数A.细菌总数的菌落计数方法（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。菌落透明度透明、半透明或不透明稍透明不透明不透明菌落与培养基结合程度结合不紧结合不紧牢固结合较牢固结合菌落颜色颜色多样颜色单调，多为乳白色，少数红色颜色多样颜色多样，且鲜艳菌落正反面颜色的差别基本不同基本相同一般不同一般不同（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表ⅪⅤ-1）。（3）若有两个稀释度，其平均菌落数在30—300之间，则应按两者菌落数以各自稀释倍数后的总数之比（稀释度高的数/稀释度低的数）来决定。若其值小于2，应报告两个总数的平均