高通量药物筛选

高通量药物筛选——余婵娟10122565高通量药物筛选•高通量药物筛选（highthroughputscreening，HTS），是指用现代科技手段，对可能作为药用的物质进行大规模的生物活性检测，从而寻找出具有药用价值的物质，为新药的开发研究奠定基础。高通量药物筛选的形成高通量药物筛选是20世纪80年代后期发展起来的高新技术。它主要由生物高通量和药物筛选结合而成。所谓的高通量就是以新的药物作为靶点，对药物的作用进行研究；而药物筛选可以简略的解释为重复性实验操作。高通量药物筛选的出现，使药物筛选逐步实现规模化、自动化和集成化，具有筛选速度快，所需样品用量少的特点。传统药物筛选高通量药物筛选药物作用分子靶点↓药物筛选↓活性化合物↓作用机制研究↓组织、器官水平研究↓药效学研究↓疾病相关动物模型研究↓人类疾病相关动物模型↓药物筛选发现有效药物↓活性化合物↓药效学研究↓组织器官水平研究↓作用机制研究↓分子细胞水平研究↓药物开发研究高通量筛选与组合化学组合化学应用组合合成的方法，可以在短时间内合成出含有102~106个化合物的化学库，为高通量药物筛选提供了物质基础。高通量筛选与组合化学组合化学实现了组合库的虚拟化，从而可以根据合成目标，获得一个虚拟组合库。然后通过相关软件，从虚拟组合库中筛选出，可能实现的、符合目标要求的药物化学式，这就得到了实验组合库。通过对虚拟组合库的优化，可以大大减少实验组合库的药物数量，这为我们节省了大量的时间和资源。新药的发现过程：1.合成化合物，2.纯化，3.鉴定结构，4.进行生物活性的测定。传统合成方法是要逐一合成，这种方法效率低、速度慢、成本高、周期长。高通量筛药物选利用组合合成方法同时和成大量化合物，然后通过生物高通量方法，对大量化合物进行高速、高效、低成本、微量化的筛选，并促进了许多新的生物活性评价方法。高通量筛选生物活性评价方法：1.组合化学样品的准备2.药理活性评价3.细胞毒性评价4.药代动力学评价5.高信息筛选技术1.组合化学样品的准备：样品登记→称量→稀释→转运→标记具体操作：样品登记时涉及样品名称、理化性质、测试目的等内容，样品入库后称取一定量并用相应的溶剂（常用而甲基亚砜）溶解后作为母液共筛选用，然后经过稀释制备工作液，实验室一般工作液分布在96孔板上，每板可以分布80个样品，剩余16个孔作为筛选时设置各种对照。一般母液经过2次100倍稀释后即可作为工作液供筛选使用。2.药理活性评价1.靶点的选择受体结合分析法、酶活性测定法、细胞活性因子测定法、代谢物质测定法、细胞活性测定法等。2.药理活性结果评价阳性率法、活性指标法、阳性药标准。对于同一结构类型、具有活性的化学样品，应将该类化合物作为一组样品，选取活性较好的样品进行进一步研究，并分析其构效关系。对于毒性较大的化学样品，就要比较其最小有效浓度和最低毒性浓度差距，然后判断其药用价值。对于结构类型完全不同的化学样品，通过活性综合分析，判断样品的药理作用的选择性。若该样品只在特定模型中表现活性，且选择性较好，则具有特定方面的开发价值；若在多种模型上都表现活性，则需通过综合资料分析其是否具有药用价值，然后再做进一步药理价值研究。3.细胞毒性评价细胞毒性终点包括细胞吸附、迁移、凋亡、分裂、分化和坏死等。因细胞的生长抑制具有较好的毒性预测性，常选择单一来源的细胞进行高通量细胞毒性筛选作为毒性的初筛。细胞毒性检测方法有：化学染料法、MTT法、LDH法、放射性核素标记法、荧光法、化学发光法、生物发光检测法。4.药代动力学评价这是一种通过建立研究候选化合物吸收、分布和代谢的体外筛选模型，根据药理学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步的合成或改造。目前常用的模型有：肝切片、培养的肝细胞、亚细胞部分如S9及肝微粒体等。5.高信息筛选技术高信息筛选技术是指通过软件（常用ArrayscanⅡTM和ImageProTM）获得高分辨率的图像，从而获得单个细胞、细胞器和细胞内药靶的多方位信息。图像一般可以反映多种细胞毒性的指征：细胞密度、溶解后pH、细胞形态、核形态和膜通透性等。高通量筛选常用分析技术1.荧光分析法2.放射性分析技术3.比色技术4.发光检测技术5.核磁共振技术荧光分析法荧光分析法的特点：灵敏度高、易于检测、实验条件简单、可以实现筛选体系的微量化等。荧光分析法包括:1.荧光强度分析法2.均相时间分辨荧光法（HTRF）3.极化荧光法（FP）4.荧光共振能量传递分析法（FRET）5.时间分辨荧光能量传递分析法（TRET）6.荧光关联光谱法（FCS）荧光强度分析法原理：许多分子带有天然荧光基团，当待测大分子本身的荧光团不够强烈而无法检测时，可结合一些荧光染料以加强其光谱特征，然后根据其荧光强度的变化进行检测。时间分辨荧光分析原理：利用激发波长、发射波长和荧光寿命的变化，对物质进行检测。该方法具有灵敏度高、无放射性危害、标记物稳定、线性范围宽、分析速度快和操作简便等优点，受到广大药物筛选工作者的关注。荧光极化（荧光偏振）原理：当处于激发期的可自由运动的荧光团分子，被平面极化的光激发，使其发射到一个固定平面，分子间的旋转碰撞导致发射光平面与激发光平面产生差别，导致极化值变化，从而进行检测。适用于：酶催化水解的检测、蛋白质互相作用、DNA诊断、生物膜的流动性变化、高通量筛选。荧光共振能量传递分析法原理：在合适的能量供体和能量受体分子间，提供一定的条件，即当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，能量就会有效转移给受体，通过记录能量转移接受体的接收时间来进行检测。时间分辨能量传递分析方法原理：常范围能量传递在荧光镧复合物和共振能力安防受体之间。优点：受体长期存活和受体信号的时间通过减少背景具有高的灵敏度，无需对试剂进行特殊处理、检测或沉淀。适用于检测大量天然产物。放射性分析技术，主要应用于检测RNA转录，测定P56激酶活性，对氨基乙酰化tRNAd进行测定以及肝炎C病毒NS3蛋白酶抑制剂的药物筛选等方面。比色技术，用于检测具有吸收性质的物质浓度，根据光线经过被检物质后被吸收的多少，来评价吸收物质的含量。是目前应用最广泛的一向检测法。核磁共振技术，通过改变碰撞能，测定复合体解离时的能量，测得配体的亲和力。在应用于NMR研究小分子化合物与生物大分子相互作用时具有明显优势。发光检测技术，有些生物和化学物质可以在一定条件下进行化学反应，产生发光现象，根据这些发光反应产生的光线强弱，判断反应的进行程度。高通量药物筛选的基本步骤：高通量药物筛选模型的建立↓操作程序的编制↓带筛样品的准备↓筛选的实施↓数据分析药物发现的基本过程初筛和复筛（分子、细胞水平）深入筛选（综合分析获得先导化合物）确证筛选（确定开发前景并进行临床研究）高通量药物筛选的前景•高通量药物筛选只经过十余年的实践检验，在药理发现理论研究、技术方法的研究及筛选结果评价的研究方面，任需要完善。而如何提高高通量药物筛选的效率和准确性，是目前亟需解决的重要问题。结束了…谢谢！参考书：杜冠华药物筛选技术与中药现代化世界科学技术——中药现代化徐俊化学多样性空间探索与组合药物设计胡娟娟、夏丽娟等药物筛选的发展与现状