02蛋白质化学1

第二节蛋白质的组成单位——氨基酸一、氨基酸一般结构特征蛋白质在酸、碱或酶的作用下，水解为氨基酸（AminoAcid）——蛋白质的基本结构单位。存在自然界中的氨基酸有数百种，但组成生物体蛋白质的氨基酸（编码氨基酸）主要有20种。氨基酸结构通式αCH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH22个特殊氨基酸•脯氨酸（亚氨基酸）NH-CH-CHOHOOH甘氨酸氨基酸的构型组成蛋白质的氨基酸除Gly（R=H）以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。D/L标记法甘油醛D/L分型为参考标准球棍式投影式透视式二、氨基酸的分类和结构依R基团结构分：非极性氨基酸（NonpolarAminoAcids）9种极性，不带电荷氨基（Polar,UnchargedAminoAcids）6/7种酸性氨基酸(-)（AcidicAminoAcids）2种碱性氨基酸(+)（BasicAminoAcids）3种含非极性R基团的氨基酸（甲硫氨酸）含极性不带电荷R基团的氨基酸含带负电荷（酸性）R基团的氨基酸含带正电荷（碱性）R基团的氨基酸三、蛋白质中修饰性氨基酸四、非蛋白质氨基酸五、氨基酸的一般性质无色晶体或粉末状熔点高：200°C紫外吸收性质：芳香、杂环氨基酸旋光性：Gly除外溶解性：一般溶于水、稀酸碱；不溶于有机溶剂色氨酸：280nm酪氨酸：278nm苯丙氨酸：259nm紫外吸收大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。旋光性组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“＋”号表示。旋光物质H2NCHCOOHCCH3OHHHCNH2COOHCCH3HHOL-（-）-苏氨酸D-（+）-苏氨酸六、氨基酸的化学性质结构→性质α-氨基，α-羧基→共性R基团→特性1.两性性质和等电点氨基酸为两性离子（兼性离子、偶极离子）两性离子(dipolarion)H2NCHCOOHRH3NCHCOOR-+氨基酸在晶体或在水中主要以兼性离子形式存在氨基酸是两性电解质H2NCHCOORH3NCHCOOR-+-+H+H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-++H++酸（供氢体）碱（受氢体）氨基酸的等点点（isoelectricpoint，pI）在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点(isoelectricpoint,pI)。氨基酸在等电点时溶解度最小。H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+++H++OH-+H++OH-H2NCHCOOR-正离子pHpI两性离子pH=pI负离子pHpI+OH-+H++OH-+H+CHNH2COOHRCHNH2COOHRCHNH3+COO-RCHNH3+COO-RCHNH2COO-RCHNH2COO-RCHCOOHRNH3+CHCOOHRNH3+实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。氨基酸等电点决定于可解离基团氨基酸等点点的计算解离常数：pK值H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+++H++OH-+H++OH-H2NCHCOOR-pK1pK2K1=[A±][H+][A+]K2=[A-][H+][A±]完全质子化多元酸Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa+lg[质子受体][质子供体]pK值：指某种解离基团有一半被解离时的pH值。甘氨酸酸碱滴定曲线pK1pK22.349.60Gly等电点的计算H3NCH2COOHH3NCH2COO-++H2NCH2COO-Gly+Gly+-Gly-H+K1H+K2K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-]则：=[Gly±][H+]K1[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly谷氨酸酸碱滴定曲线pK2pK1pK3Glu等电点的计算pK1pK2pK32.199.674.24pI=（pK1+pK2）/2=(2.19+4.25)=3.22赖氨酸酸碱滴定曲线pK2pK1pK3Lys等电点的计算pK2pK1pK32.1810.538.95pI=（pK2+pK3）/2=(8.95+10.53)=9.742.氨基酸的化学反应茚三酮反应亚硝酸反应甲醛的反应2.4—二硝基氟苯反应（FDNB）与苯异硫氰酸（酯）的反应二甲基氨基萘磺酰氯反应（DNS-Cl）氨基酸与酰化剂（苄氧羰酰氯）的反应成盐和成酯反应•茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物弱酸条件下共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。Pro——黄色（440nm）氨、胺不放CO2亚硝酸反应RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+H2O+N2↑氨基酸羟酸用途：氨基酸定量；蛋白质水解程度测定甲醛滴定甲醛反应一羟甲基衍生物二羟甲基衍生物pH=pK+log[H2NCH2COO-][H3+NCH2COO-]+OH-弱酸2.4-二硝基氟苯（FDNB/DNFB）反应（Sanger）HNHCCOOHR+F-O2NNO2H2NHCCOOHR+FO2NNO2在弱碱中室温pH8-9FDNBDNP-氨基酸（黄色）苯异硫氰酸（PITC，Edman反应）H2NCCOOHR+在弱碱中NCSHNCNCCHHOOHRHSH+NCNCCOHRHSPITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸PTC：苯氨基硫甲酰；PTH：苯乙内酰硫脲5-二甲氨基萘-1-磺酰氯反应用途：N端氨基酸标记；微量氨基酸定量H2NHCCOOHRNH3CCH3SOOCl+NH3CCH3SOOHNHCCOOHR+HClDNS-ClDNS-氨基酸荧光酰基化反应+CH2OCOClH2NCHCOONaR在弱碱中（后酸化）CH2OCONCHCOOHRH+Na++Cl-苄氧羰酰氯苄氧羰酰-氨基酸用途：蛋白质人工合成中氨基保护剂成盐和成酯反应H2NCCOOHRH+NaOH+C2H5OH干燥H2NCCOONa+H2ORHH2NCCOOC2H5+H2ORHHCl·HCl七、氨基酸的分离和分析鉴定蛋白质的水解→氨基酸混合物酸水解：6mol/LHCl,110–120۫C,24h碱水解：5mol/LNaOH110۫C,24h酶水解：（部分水解）氨基酸的分离鉴定纸层析薄层层析离子交换柱层析纸层析(paperchromatography)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：（物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值）Rf＝原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离原点前沿双向纸层析薄层层析（thin-layerchromatography）以硅胶、氧化铝、纤维素粉等为支持剂支持剂涂布于玻璃板上→均匀薄层样品滴加在薄层一端离子交换柱层析（ion-exchangecolumnchromatography）以离子交换树脂作为支持物，离子交换树脂上的活性基团可与溶液中的离子（氨基酸）进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。离子交换树脂：人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物阳离子交换树脂阴离子交换树脂AA2.975.689.74第三节蛋白质的结构自然界存在的蛋白质1010-1012组成蛋白质的氨基酸——20种20世纪50年代初，Linderstron-Long：蛋白质具有不同结构层次一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构蛋白质的分子结构包括:一、蛋白质的一级结构(primarystructure)定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序和连接方式。主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。(Peptidebond,Disulfidebond)1.肽键和肽链肽键(peptidebond):一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的共价键，又称酰胺键。NH2-CH-CHOOH甘氨酸NH2-CH-CHOOH甘氨酸NH-CH-CHOHOOH甘氨酸+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO肽键的形成-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3+胱氨酸二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3二硫键的形成半胱氨酸肽和多肽链*肽：氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*由少于10个氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。多肽链的特点*氨基酸残基(residue)：肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全。*多肽链有两端:(Amino,Carboxylterminal)N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端*结构骨干(Backbone)由-N-Cα-C-重复排列N：酰胺氮，Cα：手性碳原子，C：羰基碳H2NCHCR1OHNCHCR2OHNCHCR3OHNCHCOHRnO一级结构的含义、特点和意义含义：氨基酸种类：≤20氨基酸数目：总数，每种氨基酸数目氨基酸连接次序特点：方向性多样性意义：生物学功能的基础空间结构的基础2.几种生物活性肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)多肽类激素及神经肽体内许多激素属寡肽或多肽多肽抗菌素↓革兰氏阳性菌神经肽(neuropeptide)脑啡肽（高等动物脑组织）：内源性吗啡样活性物质，镇痛蛋氨酸脑啡肽：H—Tyr-Gly-Gly-Phe-Met—OH亮氨酸脑啡肽：H—Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu—OH3.肽链的表示方式N端C端胰岛素（Insulin）4.一级结构的测定意义：阐明蛋白质活性中心了解结构与功能的关系说明分子进化、遗传与变异等现象了解分子病发病机制人工合成蛋白质测定步骤纯化蛋白质样品测定蛋白质的分子量和氨基酸组成氨基酸末端分析（N-端、C-端）肽链的拆分肽链的部分水解分离纯化各肽段并采用Edman(PITC)降解法测序用重叠法推断肽链全部氨基酸序列二硫键的定位氨基酸末端分析N端分析方法2．4-二硝基氟苯法（FDNB）苯异硫氰酸法（PITC）二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）C端分析方法肼解法羧肽酶法2．4-二硝基氟苯法（FDNB）SangerpH8-96mol/LHClDNP肽乙酸乙酯抽提后只有DNP-氨基酸留在有机相DNP-氨基酸（黄色）苯异硫氰酸法（PITC）/Edman降解法加热Δ二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）肼解法羧肽酶法•羧肽酶A:除Lys,Arg,Pro，Pro(-2)•羧肽酶B：水解Arg,Lys,非(Pro-2)肽链的拆分非共价键：变性剂共价键：