SDS-PAGE电泳

LOGO蛋白质的SDS-PAGE电泳一.实验目的学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。二.实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。分子量范围与凝胶浓度的关系丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512～431016～687.536～945.057～212SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。凝胶由分离胶和浓缩胶组成：上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子三.实验试剂和器材1.材料：标准蛋白2.试剂：(1)30%丙烯酰胺(2)10%SDS(3)分离胶缓冲液:1.5mol/LTris-HClpH8.8(4)浓缩胶缓冲液:0.5mol/LTris-HClpH6.8试剂：(5)10%过硫酸铵(APS)溶液(6)四甲基乙二胺(TEMED)(7)SDS上样缓冲液:Tris-HCl、SDS、溴酚蓝、甘油、2-巯基乙醇(8)电极缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液）(9)染色液:甲醇、水、冰乙酸、考马斯亮蓝R250(10)脱色液:甲醇、水、冰乙酸3.实验器材：垂直板电泳装置稳压稳流电泳仪脱色摇床移液枪滤纸大培养皿各部分凝胶配制分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)ddH2O4.05ml6.8ml30%Acr3.3ml1.7mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.25ml10%SDS100µl100µl10%Ap50µl100µlTEMED10µl10µl四.实验步骤1.安装制胶模具。2.调制分离胶（10%），加入10%APS和TEMED，混匀，立即灌注至模具高度的70%。3.加一层纯水，约30min后聚合。4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。5.调制浓缩胶（5%），加入10%APS和TEMED混匀，立即灌注插入梳子。静置40min。加入分离胶溶液pH8.8封水或饱和正丁醇溶液出现明显界面时，分离胶凝聚完成（３０min~１h）倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。分离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳6.样品及标准品的准备：标准品按说明书进行处理，样品加入ddH2O溶解后，再加入SDS上样缓冲液。7.加样电泳（每孔加样15μl）。开始8V/cm（60V），染料进入分离胶时，电压提到15V/cm（110V），继续电泳，让溴酚蓝到达分离胶底部时关闭电源。8.卸下玻板，剥离凝胶放在器皿内，切去一角作为方位标记。加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.8通电分离胶pH8.8加入样品上样及电泳开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。9.染色：用至少五倍体积染色液浸泡凝胶，于平缓摇摆平台上室温1h左右。10.脱色：用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，至蛋白质条带清晰。注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。（2）凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。（3）梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。（4）微量注射器（加样器）上样时,注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔。（5）剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。（6）聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套。思考题:1.SDS在该电泳方法中的作用是什么？2.在SDS-PAGE中TEMED和AP的作用?浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层