鸡蛋溶菌酶提取

鸡蛋溶菌酶提取溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。性质：白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌作用：溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。提取工艺：（一）鸡蛋清中提取溶菌酶方法一——食盐盐析一．材料：原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂）仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机二．工艺流程：原料→清洗→去蛋壳→分离蛋清→搅拌→过滤→加盐→调节pH值→结晶→干燥→成品→包装三．实验步骤：1选择新鲜鸡蛋，蛋清的pH值不能低于8.0，否则不能用。2清洗:用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。3将鸡蛋的两端各敲一个小洞，使蛋清流出。4用搅拌机搅拌，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止由于起泡引起蛋白质的泡沫变性，而影响溶菌酶活性及产率。5过滤：用双层纱布将稠度均匀的蛋清过滤，滤除蛋清溶液中的脐带块及蛋壳等。6加盐：按50:1的比例（NaCl:蛋清液），向蛋清液中加入NaCl细粉，边搅拌边加入促使NaCl细粉及时溶解，以避免NaCl沉于容器底部，而因局部浓度过高而产生大量的白色沉淀7结晶：用1mod/l的NaOH溶液调节PH为9.5-10.0,边搅拌边加，避免过碱引起蛋白质变性。于4℃条件下静置过夜，至结晶析出。为加速其结晶过程，可加入适量溶菌酶晶种（晶种制备：将市售溶菌酶粉剂配制成５％水溶液，每10mL加入Nacl0.5g，滴加１ＭNaOH溶液调ｐＨ值至9.5—10.0，置4℃冰箱中，结晶析出即成）。不加晶种两周左右结晶率最高，反之７２—９６ｈ最高。8结晶过滤或分离：用滤纸或尼龙布过滤，或用离心机离心10min，得到溶菌酶结晶。9结晶洗涤：用丙酮将溶菌酶结晶洗涤数次（一般3次即可）。10干燥：将溶菌酶结晶在常温或（50-60）℃条件下干燥制成成品，水分含量质量分数约为（2-3）%。方法二——离子交换法一．材料原料与试剂：鲜鸡蛋（市售）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等，以上药品均为分析纯。主要仪器：分光光度计（７２３０Ｇ型）、搅拌器（２００～３００ｒｐｍ）、离心机（4000rpm）。二．工艺流程三．实验步骤１蛋黄与蛋清的分离。取新鲜的鸡蛋，去壳，经分离器后，使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散，使两者完全分离。２蛋清的预处理。将分离后的蛋清加入到搅拌器中，200-300rpm下搅拌10min，再将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起发泡为宜。最后用2-3层纱布过滤，以除去残余蛋壳和少量蛋黄。３吸附。将过滤后的蛋清冷至５℃后移入搪瓷捅中，然后在搅拌下加入已处理好的树脂（14%加入），使其悬浮在蛋清中，在０～５℃下，搅拌吸附５ｈ，然后在０－６℃静置２０ｈ以上，等分层后，弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗２－３次。以除去杂蛋白，最后晾干树脂，移入一个搪瓷缸中。４酶的洗脱。在上述树脂中加入同体积的0.15mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液，搅拌洗脱20min，过滤洗脱液，除去一部分杂质。再重复洗脱２次。将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱30min，滤出洗脱液，重复洗脱３次，滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。５沉淀。在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32％固体硫酸铵，搅拌使其溶解，在４℃放置过夜。第２天，用虹吸法取出上清，4000rpm离心10min分离沉淀物。６透析。将沉淀物用蒸馏水全部溶解，然后放入透析袋中，在10℃水中透析过夜，以除去沉淀中的硫酸铵。收集透析液。７盐析。将透析液移入一容器内，用0.1mol/L的NaOH调溶液ｐＨ至８．５~９．０，有白色沉淀时，应立即离心除去沉淀。用２mol/LHCl调ｐＨ至3.5，搅拌，并在0℃放置４８ｈ，同上离心收集沉淀物。８成品的干燥。将上述沉淀物加入到丙酮，搅拌。放置２ｈ，收集沉淀，用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末，无臭，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。方法三——离子交换法一．实验材料鸡蛋（新鲜）磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、丙酮、硫酸铵、724型阳离子交换树脂等。二．工艺流程硫酸洗脱蒸馏水，溶解pH=3.5，固体NaCl盐析三．实验步骤（1）树脂处理：将724树脂先用w（NaOH）=7%的溶液浸泡2h，滤出树脂凉干，再用c（HCI）=0.1moI/L的溶液浸泡8h，滤出树脂凉干后，用w（NaCI）=10%的溶液浸泡8h，滤出树脂凉干备用。（2）缓冲液配制：取30.0gNaH2PO4及35.8gNa2HPO4溶于1L水中即得pH=6.5的磷酸盐缓冲液。（3）原料处理：新鲜的蛋清用pH试纸测其pH值应为8.0左右。（4）吸附：用冰水冷却并搅拌蛋清，使温度降到5℃，缓缓加入724型树脂，在不断搅拌下使树脂完全悬浮于蛋清中，保持温度0~10℃，继续搅拌5h，然后将蛋清在0~10℃静置12h以上。（5）洗涤、洗脱：把上层蛋清倾出，下层树脂用清水洗去附着的蛋白质，先后共洗涤四次，最后将树脂滤去水分，用磷酸盐缓冲液分三次加入搅拌，每次搅拌15min后抽滤去水分，然后用ψ（H2SO4）=1%的稀硫酸分四次洗脱溶菌酶，合并洗脱液，在洗脱液中加入w〔（NH4）2SO4〕=40%的溶液，析出白色沉淀。在0~10℃静置12h以上，过滤出沉淀。（6）透析：将沉淀溶于蒸馏水中，在0~10C℃透析24h，除去大部分硫酸铵。（7）盐析：用滴管慢慢加入氢氧化钠溶液，pH使=8.5~9.0，如有白色沉淀，应即离心除去，然后在搅拌下加入c（HCI）=3.0mOI/L的盐酸，使溶液pH=3.5。按盐析液的体积缓缓加入w（NaCI）=5%的固体氯化钠，则有白色沉淀生成，0~10℃静置48h，抽滤得到溶菌酶粗品。（8）精制：将粗品溶菌酶溶入0℃无水丙酮中，控制溶液的ρ（粗溶菌酶）=100g/L，缓慢搅拌使颗粒松细，在0~10C℃静置数小时，滤去丙酮，沉淀真空干燥，即得溶菌酶精品。如果不用丙酮脱水，将透析液冷冻干燥可得不含氯化钠的溶菌酶。按蛋清质量计收率为0.14%。方法四——离子交换法（改进工艺）1．将新鲜鸡蛋洗净、控干水、敲破小头、收集蛋清，4℃放置1h以上。2.724树脂的处理：用1mol/LHCl浸泡树脂2h，用去离子水洗至近中性，再用1mol/LNaOH浸泡2h，用去离子水洗至近中性（用过的树脂直接用1mol/LNaOH浸泡，用去离子水洗至近中性）再用0.15mol/LpH6.5的磷酸盐缓冲液浸泡过夜，滤后备用。3.吸附。将冷蛋清加入处理好的724树脂（每千克蛋清需要未处理树脂160g）大力搅（冰浴中）吸附6h，4℃静置，次日离心（3000r/min，15min），收集树脂，回收蛋清。4.洗去杂蛋白。树脂先用去离子水洗至洗液无浑浊，再用等体积的0.15mol/LpH6.5的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤20min（冰浴下）搅拌洗涤应重复2次，最后1次滤除树脂水分。5.洗脱溶菌酶。树脂用等体积的10%的（NH4）2SO4浸泡，4℃下过夜，次日搅拌30min，洗脱液经尼龙布过滤，准确量取体积。再加入体积10%的（NH4）2SO4重复洗脱2次，合并洗脱液。6.盐析溶菌酶。每83ml洗脱液加32g磨细的固体（NH4）2SO4，在搅拌下缓慢加入，待（NH4）2SO4完全溶解后，4℃放置过夜。次日，离心（3000r/min，15min），收集沉淀。7.透析除盐。将盐析沉淀装入透析袋，用蒸馏水透析24h以上，其间换2次蒸馏水。8.去杂质。取出透析袋中的透析液，用2mol/LHCl调整pH4.6，离心，收集上清液。其沉淀加少量蒸馏水（约为沉淀的5倍）搅匀，再重复处理2次。合并上清液、调整pH5.5，再加,1mol/LNaHPO4—KH2PO4缓冲液（pH5.5）,达终浓度为10mmol/L，静置10min、离心、弃沉淀，收集纯化液。9.浓缩与干燥。纯化液在（40±2）℃真空旋转蒸发，变浊时倒出、冷冻，室温真空干燥。方法五——阳离子交换法一．实验材料1.阳离子交换树脂（７３２）树脂，聚丙烯酰胺凝胶（ｓＤｓ—ＰＡＧＥ）2.乙酸和配缓冲液用的磷酸钠与氢氧化钠等试剂均为分析纯（ＡＲ级）。3.鸡蛋从自由市场上随机购买，新鲜无异常。二．实验步骤1按照国家有关标准方法配置ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９的四种磷酸缓冲液。2鸡蛋清样品处理方法去蛋壳，手工分离得鸡蛋白，分别加ｐＨ６到ｐＨ９的缓冲液充分浸泡蛋白，均质处理上述缓冲液处理过的蛋白液（四种磷酸缓冲蛋白液）。3分离层析柱制备及溶菌酶分离方法７３２树脂经多重蒸馏水处理后，小心灌人1X30cm的柱中，再以ＰＨ６到９的缓冲液分别洗涤，制得四种缓冲能力的７３２树脂分离柱。将上述四种磷酸缓冲蛋白液分别移入相应ｐＨ值缓冲液处理过的分离柱，以相应缓冲液洗脱一定时间后，再以0.1mol/L的乙酸洗脱，在整个洗脱过程中，洗脱液每10ml收集一管，收集到的洗脱液立即经280nm检验溶菌酶和其它杂蛋白的洗脱顺序。洗脱下来的溶菌酶经冷冻于燥计算其得率，得率的计算方法是每百克鲜鸡蛋清蛋白中含冻干溶菌酶粗制品的克数。方法六——阳离子交换法1.试验材料预处理。鸡蛋清样品预处理：取新鲜蛋清，用４层纱布过滤，除去杂物。用磁力搅拌器搅拌10min，均质，速度以不引起蛋清起泡为宜。离子交换树脂的预处理：称取１００ｇ离子交换树脂，用１ｍｏｌ／Ｌ盐酸1000ｍＬ浸泡１２ｈ，倾出上清液，用清水冲洗至ｐＨ值为６．０左右，再用８０℃热水８００ｍＬ浸泡４ｈ，过滤，用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液浸泡１２ｈ，倾出上清液，用清水冲洗至ｐＨ值为９．０左右。用水浸泡备用。2.离子交换法提取溶菌酶吸附：将蛋清冰浴冷却至５℃左右，搅拌下加入３０％已处理好的Ｄ１５２离子交换树脂，使树脂全部悬浮在蛋清中。保温搅拌吸附８ｈ。然后静置分层，弃去上层清液（可回收制备蛋粉），下层树脂用清水反复洗３次，以除去杂蛋白，最后滤干树脂。洗脱：在上述树脂中加入等体积浓度为１０％的硫酸铵溶液，搅拌洗脱60min，滤出洗脱液，重复洗脱树脂３次，合并滤出的洗脱液。丙酮沉淀法：将上述所得洗脱液，用冰浴降温到４℃，搅拌下将预冷到-10℃的２倍体积的丙酮逐滴加入，放置１０ｍｉｎ，然后离心，收获沉淀。干燥：将沉淀的盐析物倒入丙酮中，不断搅拌，放置２ｈ左右，滤除丙酮，放人真空干燥箱４０℃下干燥４ｈ，得成品，称重，测酶活。