第五章--细菌检验技术

第五章细菌检验技术第一节细菌形态检验技术1第二节细菌接种与培养技术2第三节细菌生化鉴定技术3第四节微生物检验的自动化与微型化4第五节细菌的其他鉴定技术5学习目标：掌握：革兰染色的原理、操作及结果判断；细菌接种技术、培养方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应的原理。熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基和器材。了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。本章重点：★革兰染色的原理、操作方法及意义★细菌培养及生长现象★细菌生化反应及临床应用第一节细菌形态检验技术一、染色标本镜检（一）染色标本检查的一般程序1.单染色法细菌标本经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥后即可镜检（二）常用的染色方法（二）常用的染色方法2.革兰染色法【方法】（二）常用的染色方法2.革兰染色法【结果】紫色——革兰阳性菌（×1000）红色——革兰阴性菌（×1000）（二）常用的染色方法3.抗酸染色法【结果】抗酸染色结果（×1000）：红色为抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌（三）其他染色法1.特殊结构染色法（1）荚膜染色法（三）其他染色法1.特殊结构染色法（2）鞭毛染色法（三）其他染色法1.特殊结构染色法（3）芽孢染色法（三）其他染色法1.特殊结构染色法（4）异染颗粒染色法Albert染色奈瑟染色（三）其他染色法1.负染色法墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型隐球菌，×400）第一节细菌形态检验技术二、不染色标本镜检1.压滴法压滴法镜检结果：尿涂片，×400二、不染色标本镜检2.悬滴法三、其他显微镜检查第二节细菌接种与培养技术红外接种灭菌器一、基本条件培养箱生物安全柜一、基本条件培养基成份•培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。•营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子、无机盐等•水•凝固剂：琼脂、明胶•抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等•指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等基础培养基：普通琼脂平板营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血琼脂平板、巧克力琼脂平板等鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖铁培养基（KIA）及各种生化反应用培养基选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作用，用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板等增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤、GN增菌肉汤特殊培养基：厌氧培养基、L型细菌培养基培养基种类（按用途分）培养基液体培养基培养基的种类（按物理性状分类）液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。半固体培养基：含0.2％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。固体培养基：含2％～3％琼脂，用于细菌的分离培养。培养基灭菌★基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟★含糖培养基：113℃灭菌15分钟★含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次★不耐高温的液体成分：滤过除菌调配—溶化—调Ph—过滤澄清—分装—灭菌—检定—保存培养基制备程序培养基制备程序（一）无菌技术细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理标本的采集严格无菌操作无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌二、细菌接种与培养技术（二）细菌接种与分离技术灭菌接种环（针）—冷却—挑取标本（细菌）—接种—灭菌接种环（针）平板划线法分区划线连续划线分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环连续划线法斜面接种半固体穿刺接种液体接种（三）细菌培养方法•一般培养（需氧培养）：培养需氧或兼性厌氧菌培养温度：35℃～37℃培养时间：18～24小时•二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱•厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等—培养厌氧菌三、细菌的生长现象菌落与菌苔血平板上溶血现象细菌在液体培养基中生长现象菌膜对照沉淀浑浊沿穿剌线扩散生长在穿剌线上生长细菌在半固体培养基中的现象一、碳水化合物的代谢试验第三节细菌生化鉴定技术原理：多糖→单糖→丙酮酸→酸性产物(或产气)→pH↓→呈酸性变色(或出现气泡)方法：将待检细菌以无菌操作接种到糖发酵管中，置35℃温箱培养18～24h，观察结果。1、糖（醇、苷）类发酵试验结果一、碳水化合物的代谢试验原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧分子需求的不同，将细菌分为氧化、发酵和产碱型三类2、O/F试验方法：取2支HL葡萄糖培养管煮沸驱氧，冷却后接种细菌。将其中一管敞开，另一管用液体石蜡封管，培养18～24h观察结果3、甲基红试验原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，进一步分解生成大量混合酸，使培养pH下降至4.4以下，加入甲基红后，呈现红色反应。为甲基红试验阳性。方法：将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中,35℃培养18~24小时后,往培养基中加入甲基红指示剂少许,观察结果。主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌4、V-P试验原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与胍基化合物结合，生成红色化合物，是为V-P试验阳性。方法：把待检细菌接种在葡萄糖蛋白胨水中，35℃培养18~24h后，按每毫升培养液加入0.1ml含2％肌酸或肌酐的40％KOH溶液,数分钟或数小时后观察结果。结果空白对照阴性阳性5、β-半乳糖苷酶试验（ONPG）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)而生成黄色的邻硝基苯酚，该试验也称为ONPG试验。方法：将被检制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，37℃水浴5分钟，使酶释放，然后再加入0.25mlONPG，混匀后，置于37℃水浴中温育，菌悬液呈黄色为阳性反应。阴性阳性6、七叶苷水解试验原理：某些细菌能分解七叶苷产生葡萄糖与七叶素，七叶素与培养基中的Fe2+结合后，形成黑色的化合物，使培养基变黑。方法：将待检细菌接种到七叶苷培养基上，培养后观察结果，培养基变黑色者为阳性，培养基不变色为阴性。+-二、蛋白质和氨基酸的代谢原理：细菌产生色氨酸酶，分解培养基中色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质，是为靛基质试验阳性。方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，35℃培养18～24h，取出后沿试管壁加入靛基质试剂数滴，在两液面观察结果。结果1、靛基质（吲哚）试验二、蛋白质和氨基酸的代谢原理：细菌产生酶，分解含硫氨基酸生成硫化氢，硫化氢与培养基中的亚铁盐或铅盐结合生成黑色化合物。方法：将细菌穿刺接种到醋酸铅培养基中，35℃、18～24h，观察结果。结果：黑色管为阳性2、硫化氢试验原理：细菌产生脲酶，水解尿素生成氨和二氧化碳，培养基呈碱性反应方法：将待检菌接种于尿素培养基中，35℃培养18～24h取出观察。3、尿素酶试验-+原理：细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与三氯化铁作用，形成绿色化合物方法：将待检菌接种于苯丙氨酸微量培养管中（接种量稍大），培养后在培养基上直接滴加10％氯化铁试剂，出现绿色反应者为阳性。4、苯丙氨酸脱氨酶试验-+三、碳源利用试验原理：有的细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，细菌在生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐，使培养基呈碱性反应方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，培养后观察结果。培养基由淡绿色变为深蓝色者为阳性，培养基中无菌生长、仍为绿色者为阴性。1.枸橼酸盐利用试验+-四、酶类试验原理：某些细菌具有氧化酶（细胞色素氧化酶），能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色的醌类化合物。方法：取洁净滤纸条，粘取被检细菌菌落，滴加氧化酶试剂1滴于菌落上。或将试剂直接滴加在被检细菌的菌落上。阳性者立即出现红色，继而变为深红色至深紫色。1、氧化酶（细胞色素氧化酶）试验原理：细菌产生的触酶（过氧化氢酶）能催化过氧化氢放出初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。方法：取待检细菌少许，置于洁净的载玻片上，滴加3％H2O2试剂1～2滴，观察结果。一分钟内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。2、触酶试验原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。方法：于3支试管中分别加入1:4稀释的血浆0.5ml，1支管加入待检菌肉汤培养物0.5ml,另两支分别加阴阳性对照菌肉汤培养物0.5ml，35℃培养3～4h后观察结果。3、凝固酶试验（试管法）原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。方法：取未稀释的兔血浆和生理盐水各一滴分别置于载玻片的两侧，挑取金黄色葡萄球菌少许分别与它们混合，立即观察结果。细菌在生理盐水中无自凝，菌液呈均匀混浊状态凝固酶试验为阴性；菌液聚集成团块或颗粒状，则血浆凝固酶试验为阳性。4、凝固酶试验（玻片法）第三节细菌生化鉴定技术原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮磺酸，再与α-萘胺结合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(红色化合物)。方法：将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，35℃培养18～24小时，加入甲液（对氨基苯磺酸0.8g、5mol／L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g、5mol／L、醋酸100ml）等量混合液，观察结果。立即出现红色者为阳性。若加入试剂不出现红色，需要检查硝酸盐是否被还原，可于培养管内加入少许锌粉，如无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐还原试验为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检细菌无还原硝酸盐的能力，硝酸盐还原试验为阴性。5、硝酸盐还原试验红色为阳性无色为阴性5、硝酸盐还原试验-+无色+锌粉→无色：阳性无色+锌粉→红色：阴性+-原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进金黄色葡萄球菌β溶血素活性。其他链球菌不产生CAMP因子。方法：用产生β-溶血素的金黄色葡萄球菌在血平板上划种一条直线，将待检菌距金黄色葡萄球菌3mm处垂直划种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌株。35℃孵育18～24结果6、CAMP试验对照阴性阳性检测菌阳性阳性矢状溶血五、复合生化反应原理：KIA琼脂中含有牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸橼酸铵铁、酚红指示剂等。乳糖的浓度为葡萄糖的10倍，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，培养基中的葡萄糖被分解后只能产生少量的酸，在最初培养的8～11小时内，这些酸也足以使培养基的底层和斜面变黄色。但连续培养数小时后，在细菌和氧的作用下，培养基的斜面所含氨基酸发生降解，释放氨类，立即中和斜面部分的酸，培养18～24小时后，整个斜面转变成碱性，斜面又变成红色。培养基深层中，氨基酸的降解作用不足以中和所形成的酸，故仍呈黄色。因此KIA斜面呈碱性，深层呈酸性反应，说明该菌只分解葡萄糖而不分解乳糖。若细菌分解乳糖则产生大量的酸，这些酸能中和斜面产生的碱，使整个培养基呈黄色。若细菌能分解培养基中含硫氨基酸，则可产生H2S，H2S与培养基中枸橼酸铵铁起反应，产生不溶性的黑色硫化亚铁沉淀。KIA试验六、复合生化反应方法：用接种针挑取待检细菌，先穿刺接种到KIA深层，距管底3～5mm为宜，再从深层向上提起，在斜面上由下至上划线，35℃培养18～24小时，观察结果KIA试验常见的反应结果：①斜面碱性/底层碱性：不发酵糖类，如粪产碱杆菌。②斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如志贺菌。③斜面碱性/底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵，产生H2S。如沙门菌、普通变形杆菌。④斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖发酵，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属。六、复合生化反应KIA试验结果第四节微生物检验的自动化和微型化一、微生物自动培养系统（一）自动血培养检测系统1.基本原理（1）放射性物质标记法一般采用放射性碳14标记法：细菌生长时利用标记底物产生含14C的CO2，当14C标记的CO2量超过界限时，检测器报告阳性生长。（2）二氧化碳感受器每一血液培养瓶底部都含有Novel颜色感应