20161123非编码RNA和外泌体研究策略

长链非编码RNA及其外泌体研究方法长链非编码RNA及其外泌体研究方法及其外泌体研究方法及其外泌体研究方法技术部：许佶[e-mail]@ribobio.com目part1part2非编码RNA研究背景lncRNA概述及其研究方法录part4part3环状RNA概述及其研究方法外泌体概述及其研究方法一、非编码RNA基因组时代后基因组时代12RNA研究背景后基因组时代非编码RNA时代3转录组ProteinRNADNA新中心法则转录组RNAsLncRNAcircRNcircRNAncRNA研究需要解决的基本问题及其研究意义动物体内有什么样的功能？特异性表达情况如何？有哪些表达？ncRNAs通过什么样的机制调节表型？会导致什么样的细胞表型？研究需要解决的基本问题及其研究意义临床意义DurgncRNAsBiomarkDurgTarget二、lncRNA概述及研究现状NumberofPublicationsNumberofPublicationslncRNA特点：1）长度大于200nt，不编码蛋白质；2)具有组织特异性及其表达的时空特异性；3）序列保守性差；4）调控机制多样性；概述及研究现状18002000lncRNA02004006008001000120014001600180020072008200920102011201220132014201520162007200820092010201120122013201420152016图近年的长非编码文章数目统计lncRNAlncRNA测序方案测序方案线性lncRNA提取总RNA去除核糖体RNA构建文库、测序分析核糖体去除法对基因的覆盖均一度更好7核糖体去除法对基因的覆盖均一度更好1、海量数据里面如何挑选功能性1、倍数+P值2、功能注释：GO和KEGG4、分子新旧5、分子位置、海量数据里面如何挑选功能性lncRNA?KEGG3、Network：共表达与调控网络分析2、新lncRNAlncRNA序列确认lncRNA?RACENorthernblot编码蛋白能力预测编码蛋白能力验证lncRNA是否编码蛋白lncRNA如何鉴定？lncRNA表达特异性lncRNA?qRT-PCR:表达特异性、表达的时间特异性编码蛋白能力预测编码蛋白能力验证是否编码蛋白3、lncRNA功能研究方法功能siRNA反义寡核酸（ASO）功能验证反义寡核酸（ASO）Ribo™lncRNASmartSilenceCRISPR/Cas9lncRNA过表达载体体内实验InvivosiRNA化学修饰寡核酸功能研究方法4、lncRNAlncRNA调控机制通过与转录因子的相互作用参与转录调节；lncRNA-RNA作用模式；（ceRNA)；通过修饰染色体参与表观调节；lncRNA-RNA作用模式；（ceRNA)；lncRNA调控机制研究方法方案RNAFishChip-seqRNAPulldowndown目的lncRNA分子定位研究体内蛋白质与DNA相互作用;表观修饰鉴定已知RNA的蛋白质优点对lncRNA可能的作用机制快速获得转录因子结合位点；快速获得RNA能的作用机制进行预判因子结合位点；组蛋白特异性修饰位点RNA的所有蛋白调控机制研究方法RNAPulldownRIP-seqClip-seqCHIRP-seqdown鉴定已知RNA结合的蛋白质鉴定已知蛋白质结合的RNA鉴定已知蛋白质结合的RNA鉴定已知RNA结合的蛋白质和DNA快速获得RNA结合快速获得蛋白快速获得蛋白结合的所快速获得RNA的作用RNA结合的所有蛋得蛋白结合的所有RNA序列白结合的所有RNA序列RNA的作用靶标，发现特定RNA作用机制lncRNA研究经典案例一研究发现lncRNA-ATB在肝癌细胞中高表达，而且与预后差有关，并且可以结合miR-200上调ZEB1/2的表达，并诱导EMT及其ZEB1/2的表达，并诱导EMT及其肿瘤细胞的侵袭。lnRNA-ATB可以作为潜在对抗肿瘤细胞转移的靶标研究经典案例一lncRNA差异表达筛选验证及其lncRNA-seq&及其生信分析信分析lncRNA表达特异性及其预后分析双荧光素酶报告基因实验及其PIR实验验证ceRNA机制差异表达筛选验证及其ceRNA机制验证lncRNA-miRNA-mRNAmiRNA下游调控靶基因预测及其验证，靶基因与lncRNA表达的正向关系的正向关系RNAi实验验证lncRNA与下游靶基因的调控关系lncRNA调控中的级联反应mRNA表达及其调控关系调控分子细胞及其动物水平功能验证调控分子细胞及其动物水平功能验证lncRNA研究经典案例二研究经典案例二1、寻找差异的分化的DC细胞vs.单核细胞，通过芯片和lncRNA-seqDC分化过程中特异的lncRNA。并锁定LOC645638（达与DC细胞分化成熟过程非常吻合），命名为：lnc-DC、寻找差异的lncRNA位置分析：lnc-DC基因位于chr17q23，附近有蛋白编码基因HEATR6；UCSC().seq寻找（其表DC2、差异表达的lncRNAlnc-DC在RNA-seq胞等均呈现很低甚至缺乏lncRNA表征鉴定在DC细胞呈现（特异性）高表达。调用ENCODEseq测序数据，显示在B细胞，单核细胞，造血干细胞等均呈现很低甚至缺乏lnc-DC表达。差异表达的lncRNA通过Northernbolt对lncDC进行确认lncRNA表征鉴定分子序列鉴定：lnc-DC在单核细胞诱导的DC细胞中有两个转录本，通过RACE实验寻找全长转录本；lnc-DC具有polyA尾巴和5’帽结构，缺乏蛋白编码能力3、产生表达差异的原因、产生表达差异的原因Mo-DC成熟分化过程中，通过chip-seq发现lnc-DC基因发生表观修饰改变：组蛋白修饰，H3K3me,H3K27ac是两个转录功修饰，H3K3me,H3K27ac是两个转录功能上调标志；通过ChIPseq检测；PolII(RNA聚合酶)和转录因子PU.1占用通过多位点ChIP-qPCR检测，DNaseI敏感性分析（DNaseI处理后进行qPCR检测），都提示在lnc-DC的转录起始位点(TSS)附近处于开放状态；lnc-DC基因的+44to+50（相对于TSS）区域，具有PU.1典型的结合序列。设计不同长度的荧光素酶报告系统，发现突变+44to+50区域，或删除该区域，能够抑制荧光素酶表达。从而证实lnc-DC基因可以受到PU.1调控。44、差异表达、差异表达lncRNAlncRNAlncRNAlncRNA缺失性功能研究缺失性功能研究抑制lncDC表达后的细胞诸多关键基因表达下调（A），流抑制lncDC表达后的细胞诸多关键基因表达下调（A），流式细胞术检测显示诸多DC分子表面标志物表达下调（B），表明抑制lncDC表达造成造成DC分化抑制；敲减后DC细胞抗原吞噬能力下降（C）；DC细胞对CD4+T细胞增殖能力的促进作用下降；DC细胞在LPS刺激下细胞因DC细胞在LPS刺激下细胞因子IL-12A的mRNA表达下降；ELISA检测IFNg和IL2水平下调，表明抑制lncDC表达造成DC功能受到抑制差异表达差异表达lncRNAlncRNA获得性功能研究获得性功能研究获得性功能研究获得性功能研究2355、差异、差异lncRNAlncRNA的作用机制研究的作用机制研究的作用机制研究的作用机制研究lnc-DC的RNA定位：通过RNA-FISH以及对来自核和胞浆成分的RT-PCR，确定其RNA定位在胞核和胞浆成分的RT-PCR，确定其RNA定位在胞浆。利用RIP技术发现lncDC不与AGO2蛋白结合；用生物素化lnc-DC对胞浆成分进行pull-down实验，对抓下来的蛋白成分进行质谱实验，对抓下来的蛋白成分进行质谱分析，寻找lnc-DC直接结合蛋白，找到了转录因子STAT3（DC分化关键作用）。这一发现又通过免疫印迹方法进行确认（A）；通过RIP+RT-qPCR再次确认（B）。通过lnc-DC的RNA-FISH和STAT3免疫组化的共定位分析显示二者结合的大致区域一致。差异差异lncRNAlncRNA的作用机制研究的作用机制研究利用截短形式的lnc-DC进行pull-利用截短形式的lnc-DC进行pull-down，发现3’端265-417的一段能够结合SATA3。生信分析，该区域能够形成稳定的颈环结构的作用机制研究的作用机制研究构建截短形式STAT3基因表达克隆转染HEK293T构建截短形式STAT3基因表达克隆转染HEK293T细胞，然后通过：RIP-RT-qPCR实验（A）；biotin-RNApull-down实验（B）显示，STAT3C端(583to770)部分是与lnc-DC发生相互作用的区域。该区域包含一个重要的酪氨酸残基，Y705，它的磷酸化修饰对STAT3活性和核转位非常重要差异差异lncRNAlncRNA的作用机制研究的作用机制研究的作用机制研究的作用机制研究lnc-DCRNAi后，对磷酸化STAT3的免疫印迹检测，发现敲除后STAT3Y705位点的磷酸化水平降低了。Y705位点的磷酸化水平降低了。用STAT3抑制剂,S3I-201(结合C-terminal)，处理DC细胞后可以降低lnc-DC与STAT3的结合（RIP-PCR实验，E）通过lnc-DCpull-down下来的通过lnc-DCpull-down下来的蛋白质谱检测，还发现蛋白磷酸酶SHP1（A），具有重要的信号通路（如Jak/STAT通路）的负调节作用；免疫共沉淀发现，DC中敲减lnc-DC能促进SHP1-STAT3结合（B、C）三、circRNA环状RNA（circularRNA，circRNA）是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中。主要通过环化位点两边的长内含子序列及互补重复介导成环机制。circRNA概述发现Viroidsaresingle-strandedcovalentlyclosedcircularRNAmoleculesexistingashighlybase-pairedrod-likestructures.Proc.Natl.Acad.Sci.(1976)拓展Proc.Natl.Acad.Sci.(1976)Scrambledexons.Cell(1991).Circulartranscriptsofthetestis-determininggeneSryinadultmousetestis.Cell.(1993)热点CircularRNAsarethepredominanttranscriptisoformfromhundredsofhumangenesindiversecelltypes.PLoSOne.(2012)CircularRNAsarealargeclassofanimalRNAswithregulatorypotency.Nature.(2013)circRNA作用机制BiochimBiophysActa.2015BiochimBiophysActa.2015circRNA测序流程样本准备提取总RNA去除核糖体RNARNaseR去除构建文库、测序分析circRNA鉴定主要以reads的识别为基础，结合序列特征、剪接信号进行筛选RNaseR去除线性RNA鉴定主要以back-splicedjunction的识别为基础，结合序列特征、剪接信号进行筛选circRNA研究分析流程circ-seq数据处理环状RNA表达差异分析circRNA功能预测转录调控转录调控调控机制研究生物学功能研究研究分析流程差异分析环状RNA与miRNA功能预测qRT-PCR检测biomark环状RNA与miRNA互作分析ceRNAcircRNA鉴定方法环状RNA扩增原理环状RNA扩增原理设计线性RNA引物时，对向设计即可；而设计circRNA引物时，则需要背向设计，扩增产物