盐酸小檗碱片微生物限度检查法验证方案

-1-文件名称盐酸小檗碱片微生物限度检查法方法验证方案文件编号PA02-JF-C07起草人起草日期年月日审核人审核日期年月日批准人批准日期年月日执行日期年月日颁发部门版本号：1印数：分发部门分发数量010000000001验证小组人员及责任：1.1验证小组人员：小组职务姓名组长组员组员组员1.2责任：验证小组组长负责验证方案起草和编写，组织验证全过程的实施，提出验证报告。验证小组组员分别负责落实方案实施中各部分验证的具体工作。2.验证目的及标准来源：2.1验证目的：盐酸小檗碱片微生物限度试验采用薄膜过滤法进行检查。验证所使用的微孔滤膜能有效截留各类微生物、检验方法能消除盐酸小檗碱对各类微生物的抑制作用。2.2.标准来源：《中国药典》2005版二部《中国药品检验标准操作规程》2005年版-2-3.设备、仪器3.1无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。3.1.1操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。3.1.2缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。3.1.3无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～350C预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30～350C培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。3.1.4在每次操作前、后，用75%乙醇溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。3.2仪器3.2.1恒温培养箱（30～350C）、生化培养箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器。3.2.2玻璃器皿烧杯、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉花塞。玻璃器皿均于高压蒸汽1210C灭菌30min，烘干或1600C干热灭菌2h，备用。4培养基及其制备方法-3-4.1营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基32g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。4.2玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基30.5g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。4.3胆盐乳糖培养基：取胆盐乳糖培养基33.6g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。注：培养基（生物试剂）由中国药品生物制品检定所生产。5验证用菌种验证用菌株大肠埃希菌（Escherichiacoli）﹝CMCC(B)44102﹞，金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）﹝CMCC(B)26003﹞，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）﹝CMCC(B)63501﹞，白色念珠菌（Candidaalbicans）﹝CMCC(F)98001﹞，黑曲霉（Aspergillusniger）﹝CMCC(F)98003﹞。验证用微生物的稀释度和接种量菌种名称浓度/CFU·ml-1稀释级接种量/ml大肠埃希菌（Escherichiacoli）CMCC(B)44102金黄色葡萄球（Staphylococcusaureus）CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CMCC(B)63501白色念珠菌（Candidaalbicans）CMCC(F)98001黑曲霉（Aspergillusniger）CMCC(F)980035.9×1076.3×1086.7×1096.2×1087.6×10810-610-710-810-710-7111116试液-4-6.1靛基质试液6.1.1配制：取对二甲氨基苯甲醛10.0g，加入戊醇150ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸50ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。7稀释剂7.10.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。7.2PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，分装，过滤，灭菌。8样品盐酸小檗碱片三批，由吉林平安行药业有限公司生产。9供试液的制备9.1取供试品1g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10mL，混匀，作为供试品溶液。10菌液的制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30-35℃培养18-24小时。取经30-35℃培养18-24小时的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加9ml0.9%无菌氯化钠溶液，然后10倍稀释至约10-6；金黄色葡萄球菌肉汤培养物1ml，加9ml0.9%无菌氯化钠溶液，然后10倍稀释至约10-7；枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml，加9ml0.9%无菌氯化钠溶液，然后10倍稀释至约10-8，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23-28℃培养24-48小时。取经23-28℃培养24-48小时的白色念珠菌斜面培养物，加入0.9%无菌氯化钠溶液4ml洗下孢子，作为原液，取1ml加9ml0.9%无菌氯化-5-钠溶液，10倍稀释至10-7,取1ml,加9ml0.9%无菌氯化钠溶液，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23-28℃培养5-7天，取经23-28℃培养7天的斜面培养物，加入4ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，作为原液。然后,吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管中，10倍稀释至10-7,制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。11验证实验至少应进行3次独立的平行试验，分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。（1）试验组取供试液1ml和50-100cfu试验菌，采用薄膜过滤法，然后用100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（注意保持供试品溶液覆盖整个滤膜表面）。冲洗后，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备2张滤膜。测定其菌数。（2）菌液组测定所加的试验菌。（3）供试品对照组取供试液，按菌落计数方法测定其所菌数。（4）稀释剂对照组用相应的稀释液代替供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50-100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。稀释剂对照组的菌回收率（%）=稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数×100%试验组的菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%12结果判定依据稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。试验组的菌回收率均不-6-低于70%，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌数、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应建立新方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。13检查方法采用薄膜过滤法，滤膜孔径为0.45um，直径为50mm。滤膜及滤器在使用前采用121℃高压灭菌30钟。试验过程中，应保持滤膜前后的完整性。将制备好的供试液过滤，然后用100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（注意保持供试品溶液覆盖整个滤膜表面）。冲洗后，取出滤膜，菌面朝上，注入15～20ml温度不超过450C的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰钠琼脂培养基，转动平皿，置水平台上待凝。将上述平皿倒置于适宜温度的培养箱中，培养。细菌于30～35℃培养48小时，霉菌于23～28℃培养72小时。14控制菌检查方法的验证（大肠埃希菌检查法）14.1验证实验用菌种：（1）大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]（2）金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]14.2菌液的制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30-35℃培养18-24小时。取经30-35℃培养18-24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌肉汤培养物各1ml，加9ml0.9%无菌氯化钠溶液，然后10倍稀释至约10-6-10-7之间,制成每1ml含10-100cfu的菌悬液。14.3.1供试液的制备：取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，用匀浆机（3000-5000r/min、2-4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试-7-品溶液。14.3.2培养基的制备：分别取营养肉汤培养基和胆盐乳糖培养基适量，按规定的比例配制后、分装，经过121℃高压蒸汽灭菌15分钟后置于30-35℃培养18-24小时，若未变浑浊，则可留待试验时用，否则经灭菌处理后弃去。14.4控制菌检查方法的验证14.4.1试验组取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依法进行检查。14.4.2阴性菌对照组采用金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌，取10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依法检查，不得检出。14.5检查法14.5.1阳性对照试验阳性对照试验的加菌量应为10-100cfu，阳性对照试验应检出相应的控制菌。14.5.2阴性对照试验取稀释液10ml加入增菌培养基中，依法检查，阴性对照无菌生长。取胆盐乳糖培养基5份，每份100ml，其中1号管中加入1ml的供试液，2号管中加入1ml供试液和10-100cfu大肠埃希菌作为试验组，3号管中加入1ml稀释液作为阴性对照，4号管中加入10-100cfu金黄色葡萄球菌作为阴性对照组，5号管中加入10-100cfu大肠埃希菌作为阳性对照组。培养18～24小时（必要时可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述5份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛-8-基质阴性，判定供试品未检出大肠埃希菌。14.6结果判定依据阴性对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。